人Th17細胞的表型、功能特征及其與白色念珠菌感染的關(guān)系的研究.pdf

1、本論文的第一部分，我們運用RT-PCR、ELISA、ELISPOT和流式細胞術(shù)全面系統(tǒng)地研究了正常人外周血單個核細胞(PBMCs)中Th17細胞的表型及功能特征，主要研究PBMCs在不同的多克隆刺激劑刺激后產(chǎn)生IL-17的量，產(chǎn)生IL-17的T細胞亞群的頻率，IL-17與Th1/Th2型細胞因子的關(guān)系，Th17細胞與Treg細胞的關(guān)系，Th17細胞的表型如記憶細胞標志、活化標志和趨化因子表達情況等。同時我們還對純化的CD4+T細胞中IL

2、-17 mRNA和IL-17的表達進行了研究。結(jié)果表明，多克隆刺激劑anti-CD3加anti-CD28 mAb單克隆抗體(anti-CD3+anti-CD28 mAb)或PMA+Ionomycin刺激后，正常人PBMCs中IL-17mRNA的表達大大增強，并產(chǎn)生大量的IL-17，與刺激劑anti-CD3+anti-CD28 mAb相比，PMA+Ionomycin刺激產(chǎn)生的IL-17的量更大。同時，ELISPOT的結(jié)果顯示，在anti-

3、CD3+anti-CD28 mAb刺激后，106 PBMCs中平均有114個細胞產(chǎn)生IL-17。產(chǎn)生IL-17的T細胞亞群分析顯示IL-17主要由CD4+T細胞所產(chǎn)生，其陽性頻率在anti-CD3+anti-CD28 mAb和PMA+Ionomycin刺激后分別為0.53±0.29％和1.63±0.72％，表達IL-17的CD8+T細胞的頻率在兩種刺激劑刺激后均較低，分別為0.11±0.05％和0.11±0.07％。而且多克隆刺激劑在轉(zhuǎn)

4、錄及蛋白水平直接誘導純化的CD4+T細胞產(chǎn)生了大量的IL-17，從而證實了正常人PBMCs中存在一群對多克隆刺激劑應答的Th17細胞。表型分析發(fā)現(xiàn)Th17細胞表達CD45RO、CD69及趨化因子受體CCR6和CCR4，不表達CD45RA，部分表達CCR7，細胞呈現(xiàn)活化記憶細胞的表型，而且部分細胞為中央性記憶細胞。在對IL-17和Th1/Th2型細胞因子的關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，anti-CD34+anti-CD28 mAb刺激后，大約有10％

5、產(chǎn)生IL-17的CD4+T細胞表達IFN-γ，30％產(chǎn)生IL-17的CD4+T細胞表達IL-2，但IL-17幾乎不與Th2型細胞因子共表達。對比分析CD4+IL-17+T細胞和CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)中Foxp3和CTLA4的表達情況，結(jié)果表明，CD4+IL-17+T細胞和CD4+CD25high Treg細胞都高表達CTLA4，但只有CD4+CD25high Treg細胞表達Foxp3，說明Th17細胞不同于T

6、reg細胞。 本論文的第二部分我們首先研究了正常人PBMCs中白色念珠菌特異性的Th17細胞。運用RT-PCR、ELISA、ELISPOT和流式細胞術(shù)等實驗手段，我們主要研究了PBMCs在熱滅活的白色念珠菌的孢子或菌絲刺激后產(chǎn)生IL-17的量，產(chǎn)生IL-17的陽性細胞頻率等。結(jié)果表明，白色念珠菌的孢子和菌絲刺激均可大大增加PBMCs中IL-17 mRNA的表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中的IL-17得到了類似的結(jié)果。同樣，

7、ELISPOT的結(jié)果顯示，白色念珠菌的孢子或菌絲刺激后，106PBMCs中平均大約有18個細胞產(chǎn)生IL-17。而且，流式細胞術(shù)分析表明，白色念珠菌的孢子或菌絲刺激PBMCs后，盡管陽性頻率不高，但大多數(shù)正常人PBMCs中都能檢測到產(chǎn)生IL-17的CD4+T細胞，揭示正常人PBMCs中存在一群白色念珠菌特異性的Th17細胞。隨后，我們以正常人和白色念珠菌感染者為研究對象，對比分析了二者PBMCs在白色念珠菌刺激后產(chǎn)生IL-17的量，Th1

8、7細胞的頻率和抗原特異性Th17細胞的表型。結(jié)果顯示，白色念珠菌感染者的PBMCs在白色念珠菌刺激后產(chǎn)生更高的IL-17，抗原特異性的Th17細胞的頻率也高于正常對照，但二者的Th17細胞都呈現(xiàn)記憶細胞的表型。 綜上所述，我們的研究證實正常人PBMCs中存在一群記憶性Th17細胞，Th17細胞與Th1/Th2細胞及Treg細胞不同。同時發(fā)現(xiàn)部分記憶性Th17細胞是白色念珠菌特異性的，白色念珠菌感染者的PBMCs在白色念珠菌刺激后