IFN-α抑制卵巢漿液性囊腺癌增殖和腹膜轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究.pdf

1、本文通過檢測(cè)了52例卵巢漿液性囊腺癌組織中HIF-1α、VEGF、bFGF、CD34蛋白的表達(dá)情況，及上述因子在31例晚期患者腹水及轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，探討HIF-1α、VEGF、bFGF在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、腹水形成和腹膜播散中的作用，探討其與預(yù)后的關(guān)系。建立卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株低氧模型，檢測(cè)在低氧條件下IFN-α干預(yù)后，HIF-1α、VEGF、bFGF的蛋白表達(dá)變化，研究IFN-α在低氧條件下對(duì)卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株OVCAR<,3

2、>增殖和血管生成的作用，進(jìn)一步探討IFN-α抑制卵巢漿液性囊腺癌腹腔播散轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 研究材料與方法： 一、病例資料 自2001年8月～2005年1月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院診斷為卵巢漿液性囊腺癌的病人52例，所有病例均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)，由同一病理專家復(fù)核確認(rèn)?；颊吣挲g22～71歲，平均(45.2±12.3)歲，術(shù)前均未接受放射治療及化學(xué)藥物治療。病理分化程度：高分化11例，中分化16例，低分化25例；臨床分期[

3、按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FICO)標(biāo)準(zhǔn)，2000年]：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期30例，Ⅳ期2例；無腹水者21例，有腹水者31例。其中3例行全子宮切除，雙附件切除術(shù)，41例行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，殘留病灶直徑≤2cm(其中4例行部分結(jié)腸或直腸切除術(shù))，8例行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，殘留病灶直徑>2cm。其中49例患者術(shù)后給予CP或TP方案化療6-8個(gè)療程，52例患者中21人復(fù)發(fā)。所有患者均隨訪(隨訪時(shí)間22個(gè)月-39個(gè)月)，隨訪內(nèi)容包括：盆腔檢查、CA1

4、25測(cè)定、盆腹腔超聲檢查，術(shù)后頭兩年，3個(gè)月一次，以后6個(gè)月一次。另外，對(duì)有腹水的31例晚期患者，分別取腹水沉渣和腹腔轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行檢測(cè)，轉(zhuǎn)移灶部位：23例為大網(wǎng)膜，13例為闌尾，3例為腹壁，2例為結(jié)腸。 卵巢漿液性囊腺瘤20例，年齡20～76歲，平均年齡(42.7±13.5)歲，卵巢交界性漿液性囊腺瘤9例，年齡20～71歲，平均年齡(47.7±15.2)歲，正常卵巢組織10例，年齡為28～66歲，平均年齡為(48.3±11.6)歲

5、。 二、研究材料： 鼠抗人：HIF-1α多克隆抗體、survivin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人VEGF、bFGF單克隆抗體，鼠抗人tubulin單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，鼠抗人CD34、PCNA單克隆抗體購(gòu)自北京中山試劑公司，二抗羊抗鼠、羊抗兔單克隆抗體購(gòu)自北京中山試劑公司，VEGF和bFGF試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，bFGF購(gòu)自深圳晶美試劑公司，IFN-αⅡb購(gòu)于北京三元基因公司

6、，4℃保存，PI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CoCL<,2>購(gòu)白沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠，ECL，發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)PE公司。 三、研究方法： 1、腫瘤組織原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶HIF-1α、VEGF、bFGF、CD4、PCNA免疫組化檢測(cè)，采用S-P免疫組化二步法。 2、腹腔液細(xì)胞HIF-1、VEGF、bFGF免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，采用En Vision免疫細(xì)胞化學(xué)染色法。 3、血清和腹腔液上清VEGF及bFGF水平檢測(cè)，采用雙

7、抗體夾心ELISA法。 4、采用CoCL<,2>建立細(xì)胞化學(xué)性低氧模型。 5、采用MTT法測(cè)定增殖率和抑制率。 6、采用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)和細(xì)胞周期解析。 7、采用Western blot解析細(xì)胞株HIF-1α、VEGF、bFGF和survivin的蛋白表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果： 1、HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢漿液性囊腺癌中的高表達(dá)率明顯高于正常卵巢組織和

8、卵巢漿液性囊腺瘤，其差異有顯著性(P<0.001)；而且HIF-1α、VEGF、bFGF蛋白在卵巢交界性漿液性囊腺瘤的高表達(dá)率也高于正常卵巢組織和卵巢漿液性囊腺瘤，差異有顯著性(P<0.001)。 2、低分化、Ⅲ期+Ⅳ期和腹水陽(yáng)性HIF-1α蛋白的高表達(dá)率明顯高于高中分化、Ⅰ期+Ⅱ期和腹水陰性者，差異具有顯著性(P<0.05)；HIF-1α蛋白表達(dá)與年齡無關(guān)，差異無顯著性(P>0.05)。 3、HIF-1α蛋白高表達(dá)與V

9、EGF、bFGF高表達(dá)及MVD具有明顯的正相關(guān)(P<0.01)，150μmol/LCoCL2處理OVCAR<,3>細(xì)胞24小時(shí)，可上調(diào)細(xì)胞HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，對(duì)bFGF蛋白表達(dá)無影響。 4、常氧培養(yǎng)條件下，不同濃度的bFGF作用OVCAR<,3>細(xì)胞24小時(shí)，25、50和100ng/ml的bFGF均上調(diào)OVCAR<,3>細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性(P<0.01)；50 ng/ml的bFGF分別作用OVC

10、AR<,3>細(xì)胞6、12、24和48小時(shí)，均上調(diào)OVCAR<,3>細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間依賴性(P<0.01)。 5、HIF-1α、VEGF蛋白在31例晚期卵巢漿液性囊腺癌原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)高于腹水中的表達(dá)(P<0.05)，bFGF蛋白在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和腹水的高表達(dá)率分別是83.9％、90.3％和61.3％，無顯著差異(P>0.05)。 6、卵巢漿液性囊腺癌患者血清中VEGF、bFGF平均水平明顯高于正常

11、對(duì)照、卵巢漿液性囊腺瘤和卵巢交界性漿液性囊腺瘤患者(P<0.05)，腹水中VEGF、bFGF平均水平明顯高于血清(P<0.01)。 7、殘留病灶、HIF-1α、VEGF、bFGF高表達(dá)及MVD與卵巢漿液性囊腺癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移具有明顯的正相關(guān)(P<0.05)。Cox模型分析，VEGF高表達(dá)及MVD是晚期卵巢漿液性囊腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)。 8、 150μmol/LCoCL<,2>作用48小時(shí)誘導(dǎo)OVCAR<,3>

12、細(xì)胞Go/G<,1>期阻滯，未見明顯凋亡。 9、 150μmol/LCoCL<,2>作用24小時(shí)下調(diào)survivin蛋白表達(dá)，survivin蛋白表達(dá)與HIF-1α呈負(fù)相關(guān)(P<0.001)。 10、低氧培養(yǎng)條件下，10<'2>、10<'3>和10<'4>TU/ml的IFN-αⅡb均下調(diào)OVCAR<,3>細(xì)胞：HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)，且呈濃度依賴性(P<0.05)。濃度為10<'2> IU/ml的IFN-αⅡb分

13、別作用OVCAR<,3>細(xì)胞6、12、24和48小時(shí)，HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)均下調(diào)，且呈時(shí)間依賴性(P<0.05)。 11、濃度為10<'2>IU/ml的IFN-αⅡb作用72小時(shí)和10<'3>IU/ml的IFN-αⅡb作用48、72小時(shí)和10<'4>IU/ml的IFN-αⅡb作用24、48、72小時(shí)對(duì)OVCAR<,3>細(xì)胞的增殖均具有一定的抑制作用(P<0.05)。 12、低氧培養(yǎng)24小時(shí)， 10<'3>和10

14、<'4>IU/ml的IFN-αⅡb誘導(dǎo)OVCAR<,3>細(xì)胞S-G<,2>/M期阻滯，在本實(shí)驗(yàn)中，未見明顯細(xì)胞凋亡。 13、低氧培養(yǎng)條件下，10<'2>、10<'3>和10<'4>IU/ml的IFN-αⅡb均下調(diào)OVCAR<,3>細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)，與對(duì)照相比，差異顯著(P<0.001)，無濃度依賴性(P>0.05)。 研究結(jié)論: 1、HIF-1α、VEGF和bFGF在卵巢漿液性囊腺癌發(fā)生、侵襲和腹膜轉(zhuǎn)

15、移中有重要的作用。 2、bFGF通過上調(diào)卵巢癌OVCAR<,3>細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)而促進(jìn)VEGF蛋白表達(dá)。 3、VEGF及MVD是晚期卵巢漿液性囊腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。 4、HIF-1α下調(diào)survivin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)G<,0>/G<,1>期細(xì)胞阻滯，上調(diào)VEGF蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。 5、IFN-αⅡb通過下調(diào)survivin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)S-G<,2>/M期阻滯和下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)抑