IFN-γ聯(lián)合化療藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞株協(xié)同抗增殖作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：目前乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性健康的重大威脅，且發(fā)病率逐年升高，手術(shù)為主的綜合治療是主要治療模式，其中全身化療雖然可改善患者生存，卻伴有嚴(yán)重的毒副作用，而生物治療作為一種綠色療法越來越受到關(guān)注。干擾素γ(interferon gamma，IFN-γ)作為一種新型免疫調(diào)節(jié)因子在惡性腫瘤治療中取得較好的療效，但在乳腺癌中尚無研究。基于上述研究背景，本研究篩選出對(duì) IFN-γ和化療藥敏感的乳腺癌細(xì)胞株，初步探討IFN-γ聯(lián)合化療藥抑制乳腺癌

2、細(xì)胞株增殖的協(xié)同效應(yīng)，并進(jìn)一步研究其在基因水平的發(fā)生機(jī)制，以期為IFN-γ聯(lián)合化療藥在乳腺癌臨床治療中提供參考。
　　方法：首先將乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453、MDA-MB-231、MCF-7、BR3、HCC-1937置于96孔板培養(yǎng)，分別以不同濃度IFN-γ（0、60 IU/ml、200 IU/ml、600 IU/ml、2000 IU/ml、6000 IU/ml、20000 IU/ml）、不同濃度ADM（0、0.01μM、0

3、.03μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM）、不同濃度CDDP（0、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM）處理。培養(yǎng)96h后，采用水溶性四唑鹽（WST-8）比色法用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定450nm處各孔OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，比較 IFN-γ、ADM、CDDP對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株增殖抑制作用的敏感度，選取IFN-γ抗增殖作用最明顯的細(xì)胞株及抗增殖作用最明顯的IFN-γ、ADM、CDDP的藥物濃度。然后將IFN-

4、γ分別與ADM、CDDP聯(lián)合作用96小時(shí)后，將空白對(duì)照組MCF-7乳腺癌細(xì)胞株增殖活性設(shè)為100％，將IFN-γ濃度梯度作為橫坐標(biāo)，ADM、CDDP濃度梯度分別作為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)96小時(shí)后應(yīng)用WST-8比色法檢測(cè)不同藥物配比濃度下相應(yīng)孔在450nm處 OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線，使用 CalcuSyn軟件檢測(cè)IFN-γ與ADM、CDDP聯(lián)合作用于乳腺癌細(xì)胞時(shí)是否具有協(xié)同作用，基于WST結(jié)果計(jì)算結(jié)合指數(shù)（combination index，C

5、I）和單獨(dú)成分影響值（fractions affected，F(xiàn)a），CI＜1、CI＝1、CI＞1分別表達(dá)兩者之間具有協(xié)同、相加、拮抗作用；選取IFN-γ同ADM、CDDP具有協(xié)同作用的組別，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction, qPCR）技術(shù)檢測(cè)IFN-γ、ADM、CDDP單獨(dú)作用及IFN-γ分別與ADM、CDDP聯(lián)

6、合作用于乳腺癌細(xì)胞株后抑癌基因TRAIL表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1 IFN-γ、ADM、CDDP對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株的作用：不同濃度的IFN-γ對(duì)乳腺癌細(xì)胞株 BR3、HCC-1937的抑制增殖作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）；不同濃度的IFN-γ對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231抑制增殖作用的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），且對(duì)MCF-7、MDA-MB-453、MDA-M

7、B-231三個(gè)乳腺癌細(xì)胞株在既定濃度范圍內(nèi)（0-20000IU/ml）隨 IFN-γ濃度增加抑制增殖作用增強(qiáng)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），同一濃度的IFN-γ對(duì)MCF-7的增殖抑制作用最為明顯；不同濃度的化療藥ADM和CDDP對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞株均具有抗增殖作用，且均隨藥物濃度增加而抗增殖作用增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。
　　2 IFN-γ聯(lián)合 ADM或 CDDP對(duì)乳腺癌 MCF-7細(xì)胞株的作用

8、：經(jīng)CalcuSyn軟件分析，IFN-γ聯(lián)合化療藥 ADM聯(lián)合作用于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，F(xiàn)a在0.2-0.8之間，CI＜1，表明兩者同時(shí)作用于MCF-7時(shí)具有協(xié)同抗增殖作用；IFN-γ聯(lián)合化療藥CDDP聯(lián)合作用于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7， Fa在0.2-0.8之間，CI＜1，表明兩者同時(shí)作用于MCF-7時(shí)具有協(xié)同抗增殖作用。
　　3流式細(xì)胞儀檢測(cè)IFN-γ聯(lián)合ADM或CDDP細(xì)胞周期分布情況：分別以IFN-γ（6000 IU/m

9、l）、ADM（0.03μM）、CDDP（0.3μM）作用于乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞96h后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，三組細(xì)胞中subG1期比例較對(duì)照組升高（分別為對(duì)照組2.45%，IFN-γ組8.88%、ADM組7.98%、CDDP組7.47%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IFN-γ分別聯(lián)合ADM或CDDP，作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞株96小時(shí)后，聯(lián)合作用組細(xì)胞中subG1期比率均較單一用藥組增高（分別為IFN-γ聯(lián)合ADM組33

10、.52%，IFN-γ先于 ADM組26.77%，ADM先于 IFN-γ組30.97%， IFN-γ聯(lián)合CDDP組29.63%，IFN-γ先于 CDDP組31.02%，CDDP先于 IFN-γ組29.71%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。
　　4 qPCR技術(shù)檢測(cè)IFN-γ、ADM、CDDP單獨(dú)作用及IFN-γ分別與ADM、CDDP聯(lián)合作用抑癌基因TRAIL表達(dá)水平：IFN-γ、ADM、CDDP單一用藥組較空白對(duì)照組TR

11、AIL表達(dá)水平上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），IFN-γ聯(lián)合ADM、IFN-γ聯(lián)合CDDP組較單一用藥組TRAIL表達(dá)水平較均著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 IFN-γ對(duì)不同乳腺癌細(xì)胞株抗增殖作用不同，對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抗增殖作用最為明顯，且一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性。
　　2 IFN-γ聯(lián)合ADM或IFN-γ聯(lián)合CDDP均可顯著增強(qiáng)化療藥對(duì)MCF-7細(xì)胞株的抗增殖作

12、用，且IFN-γ與ADM和IFN-γ與CDDP均有協(xié)同作用。
　　3 IFN-γ聯(lián)合ADM或IFN-γ聯(lián)合CDDP均可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7 subG1期增加，增強(qiáng)抗細(xì)胞增殖作用。
　　4 IFN-γ、ADM、CDDP均可上調(diào)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中TRAIL基因表達(dá)水平，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡；IFN-γ聯(lián)合ADM或IFN-γ聯(lián)合CDDP分別較IFN-γ、ADM、CDDP組TRAIL基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，加速乳腺癌細(xì)胞凋亡