CRH相關(guān)肽受體在腸炎相關(guān)性腸癌發(fā)生及發(fā)展中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)腸癌在發(fā)達(dá)國(guó)家是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，是我國(guó)癌癥死亡最常見(jiàn)的原因之一。研究顯示，患有炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)如潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)患者和克隆病患者，其罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于普通人群。
　　促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)及其相關(guān)肽優(yōu)洛可定Ucn1(Urocortin1)，Ucn2

2、和Ucn3同為促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素家族肽成員，并通過(guò)CRHⅠ型受體（Corticotropin-releasing hormone receptor1，CRHR1）和CRHⅡ型受體（Corticotropin-releasing hormone receptor2，CRHR2）兩種跨膜G蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用。CRH和Ucn1對(duì)CRHR1有較高親和力，而Ucn2和Ucn3主要對(duì)CRHR2有親和作用。有大量的文獻(xiàn)證實(shí)在外周，CRH家族肽

3、能夠發(fā)揮促炎效應(yīng)，調(diào)節(jié)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、橋本氏甲狀腺炎和UC等多種炎性疾病。
　　早在上世紀(jì)九十年代，便有文獻(xiàn)報(bào)道CRH家族肽及其受體在胃腸道系統(tǒng)中有所分布，并且能夠調(diào)節(jié)腸道炎癥。然而，CRH家族肽對(duì)腸炎相關(guān)性腸癌(Colitis-associated cancer, CAC)的發(fā)生及發(fā)展作用一直未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討在CAC小鼠模型中，CRHR1對(duì)腸炎相關(guān)性腸癌發(fā)生及發(fā)展的調(diào)節(jié)作用。此論文分別從觀察CRHR1在CAC小鼠模型及結(jié)腸

4、癌病人體內(nèi)的表達(dá)及其分布;CRHR1對(duì)模型小鼠CAC的調(diào)節(jié)作用研究;CRHR1對(duì)CAC的調(diào)節(jié)作用起始時(shí)點(diǎn)的確定以及CRHR1對(duì)CAC的調(diào)節(jié)作用的機(jī)制研究這四個(gè)部分進(jìn)行闡述。
　　第一部分 CRHR1在CAC模型小鼠結(jié)腸部位的表達(dá)和分布
　　目的:觀察CRHR1及其配體在CAC小鼠和結(jié)腸癌病人腸道內(nèi)的表達(dá)及其分布。
　　方法:利用氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）和葡聚糖硫酸鈉（Dextransodium

5、sulfate，DSS）兩種藥物建立CAC模型小鼠。通過(guò)實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Western blotting，WB)技術(shù)檢測(cè)CRHR1及其配體Ucn1和CRH在CAC小鼠腸道中的表達(dá);采用免疫組化方法觀察CRHR1及其配體Ucn1和CRH在CAC小鼠和結(jié)腸癌病人腸道中的表達(dá)及其分布。
　　結(jié)果:AOM和DSS相互作用在小鼠造模第80天結(jié)腸部

6、位可見(jiàn)腺癌發(fā)生，造模成功。CRHR1及其配體CRH和Ucn1在CAC小鼠腸道表達(dá)明顯高于未造模小鼠;免疫組化結(jié)果顯示，CAC小鼠結(jié)腸部位的CRHR1及其配體的表達(dá)明顯高于未造模小鼠，在結(jié)腸癌病人結(jié)腸組織中的分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，腺癌區(qū)域CRHR1的表達(dá)明顯高于癌旁區(qū)域;最后，免疫組化的結(jié)果顯示CRHR1及Ucn1主要分布在小鼠結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的區(qū)域。
　　結(jié)論:在CAC小鼠結(jié)腸部位，CRHR1的表達(dá)明顯升高且主要分布于炎癥浸

7、潤(rùn)區(qū)域，暗示CRHR1可能參與調(diào)節(jié)CAC的發(fā)生和發(fā)展。
　　第二部分 CRHR1對(duì)模型小鼠CAC的調(diào)節(jié)作用
　　目的:觀察CRHR1在CAC模型小鼠中的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:將小鼠體內(nèi)的CRHR1整體敲除，利用AOM和DSS造CAC模型。記錄造模80天期間，CRHR1-/-小鼠和CRHR1+/+小鼠的存活率及體重變化;并在造模第80天，將兩組小鼠結(jié)腸取出，分析其結(jié)腸部位的腫瘤大小，數(shù)目及腫瘤發(fā)生率;利用免疫組化對(duì)兩組小

8、鼠的結(jié)腸進(jìn)行組織學(xué)分析，并對(duì)其炎癥、潰瘍、增生、及損傷面積進(jìn)行評(píng)分;最后，利用qRT-PCR和WB技術(shù)分析兩組小鼠結(jié)腸部位的炎癥因子表達(dá)。
　　結(jié)果:造模早期，CRHR1-/-小鼠存活率明顯高于CRHR1+/+小鼠，其體重下降率也低于CRHR1+/+小鼠;造模80天結(jié)束后，CRHR1-/-小鼠結(jié)腸部位腫瘤數(shù)目及大小都明顯小于CRHR1+/+小鼠，且腫瘤發(fā)生率明顯低于CRHR1+/+小鼠;組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，40％的CRHR1-/-小鼠

9、出現(xiàn)高級(jí)別異型增生且沒(méi)有腺癌發(fā)生，而70％的CRHR1+/+小鼠多呈現(xiàn)高級(jí)別異型增生，且其中30％的小鼠出現(xiàn)腺癌;此外，組織學(xué)評(píng)分顯示CRHR1-/-小鼠在炎癥、潰瘍、增生及損傷面積的評(píng)分都明顯小于CRHR1+/+小鼠。最后，qRT-PCR及WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRHR1-/-小鼠結(jié)腸部位的細(xì)胞因子，如白介素-1β(interleukin, IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）

10、的表達(dá)都明顯低于CRHR1+/+小鼠，而抗炎因子IL-10的表達(dá)明顯高于CRHR1+/+小鼠。
　　結(jié)論:CRHR1在CAC模型小鼠中起到明顯的促癌和促炎效應(yīng)。
　　第三部分 CRHR1對(duì)CAC調(diào)節(jié)作用起始時(shí)點(diǎn)的確定
　　目的:明確CRHR1在CAC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮促癌及促炎效應(yīng)的起始時(shí)點(diǎn)。
　　方法:分別取出造模第10天、15天、25天的小鼠結(jié)腸，觀察兩組小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度及其組織學(xué)差異;利用qRT-PCR分析造

11、模第10天、15天、20天、25天小鼠結(jié)腸部位炎癥因子的表達(dá)情況;最后，利用免疫組化技術(shù)分析在造模第25天，兩組小鼠結(jié)腸部位炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。
　　結(jié)果:分別取出兩組小鼠造模第10天、15天、25天小鼠的結(jié)腸發(fā)現(xiàn)，從第10天開(kāi)始，CRHR1-/-小鼠的結(jié)腸普遍長(zhǎng)于CRHR1+/+小鼠;組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在造模早期（第10天、15天、25天），CRHR1-/-小鼠結(jié)腸部位發(fā)生的粘膜損傷與修復(fù)、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及其異型增生的情況，都好于

12、C RHR1+/+小鼠，組織學(xué)評(píng)分也進(jìn)一步證實(shí)此結(jié)果;此外，在這一階段（第10天、15天、25天），CRHR1-/-小鼠結(jié)腸部位的促炎因子IL1-β，IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平明顯低于CRHR1+/+小鼠，而抗炎因子IL-10的mRNA水平逐漸高于CRHR1+/+小鼠。最后，免疫組化的結(jié)果顯示在造模第25天，CRHR14-小鼠結(jié)腸部位浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞少于CRHR1+/+小鼠。
　　結(jié)論:CRHR1在CAC發(fā)生早

13、期開(kāi)始發(fā)揮促炎及促癌效應(yīng)。
　　第四部分 CRHR1對(duì)CAC的調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　目的:CRHR1在CAC模型小鼠中發(fā)揮促炎和促癌效應(yīng)的機(jī)制研究。
　　方法:采用免疫組化的方法對(duì)結(jié)腸浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞（淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）進(jìn)行鑒定，并利用雙重染色的方法定位CRHR1主要表達(dá)的炎癥細(xì)胞類型;利用流式細(xì)胞技術(shù)分析CRHR1-/-小鼠和CRHR1+/+小鼠的外周血單核細(xì)胞的數(shù)目;利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked

14、immunosorbent assay，ELISA)分析小鼠外周血分離出的單核細(xì)胞分泌炎癥因子的水平。WB技術(shù)分析兩組小鼠結(jié)腸部位核因子kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription，STAT3)兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá);最后，利用Tunel檢測(cè)法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-

15、deoxyUridine，Brdu)檢測(cè)法分別分別兩組小鼠結(jié)腸部位細(xì)胞的凋亡和增殖能力，并用WB技術(shù)分析凋亡蛋白的表達(dá)加以佐證。
　　結(jié)果:免疫組化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRHR1多表達(dá)于巨噬細(xì)胞中;且流式的結(jié)果顯示，CRHR1-/-小鼠外周血內(nèi)的單核細(xì)胞數(shù)目少于CRHR1+/+小鼠;ELISA的結(jié)果顯示，CRHR1-/-小鼠的外周血單核細(xì)胞分泌的IL-6和TNF-α少于CRHR1+/+小鼠，而分泌IL-1β和IL-10的水平相差無(wú)幾;WB結(jié)

16、果顯示，CRHR1-/-結(jié)腸部位的NF-κB和STAT3的磷酸化水平明顯低于 CRHR1+/+小鼠，且NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移水平也少于CRHR1+/+小鼠。最后，Tunel分析顯示CRHR1+/+小鼠結(jié)腸部位的凋亡細(xì)胞少于CRHR1-/-小鼠，且促凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，BCL-2)表達(dá)上調(diào)而抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(BCL-2-associatedXprotein, Bax)表達(dá)下調(diào)