DNM1L蛋白介導的線粒體自噬在鎘致肝臟毒性中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　鎘（Cadmium），是一種毒性非常大的工業(yè)和環(huán)境污染物。隨著我國社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，重金屬元素鎘由于其在工業(yè)中的廣泛應用，對水源，土壤和農(nóng)產(chǎn)品的污染已經(jīng)給眾多地區(qū)的人民健康造成了巨大的危害。鎘具有很強的蓄積性，可因生物積累和生物放大對肝臟、腎臟等器官產(chǎn)生一系列損傷。目前，鎘已經(jīng)被美國毒性管理委員會列為第6位危害人類健康的有毒物質。鎘可以通過食物鏈進行轉移，也可以經(jīng)過呼吸道吸入，例如在生產(chǎn)與使用過程中的鎘粉塵及吸煙

2、時煙草中的鎘。線粒體是鎘損傷的重要細胞器之一。研究發(fā)現(xiàn)，鎘能夠引起線粒體DNA(mtDNA)減少，呼吸鏈蛋白減少，線粒體質量下降。但是這一機制目前仍然不是非常清楚。線粒體自噬是一種選擇性的自噬過程，是損傷線粒體降解，維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和線粒體功能重要方法之一。但是過度的或者紊亂的線粒體自噬會導致細胞內(nèi)線粒體過度降解從而引起細胞能量代謝障礙，甚至細胞死亡。本課題在明確鎘引起的肝臟毒性效應的條件下，研究鎘是如何引起線粒體丟失，揭示過度的線粒

3、體自噬在鎘致線粒體丟失中的重要作用;通過研究Ca2+-DNM1L介導的過度線粒體自噬，探討線粒體自噬在鎘毒性中的重要作用。
　　研究內(nèi)容:
　　①以CCK-8實驗等方法評價CdCl2對正常肝臟細胞株L02細胞的毒性效應;進一步檢測CdCl2對線粒體質量、ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ的蛋白含量以及線粒體DNA的拷貝數(shù)等反應線粒體丟失的指標的影響;在鎘暴露條件下，檢測L02細胞中自噬流的水平。通過蛋白印記實驗檢測自噬相關蛋白

4、LC3、SQSTM1蛋白水平。電鏡觀察自噬小體的水平。通過GFP-LC3與TOMM20共定位檢測含有線粒體的自噬小體，LysoTraker與MitoTraker共定位檢測含有線粒體的自噬溶酶體的變化。進一步通過溶酶體活性抑制劑巴弗洛霉素A檢測鎘對自噬流的影響。最后，通過調控的線粒體自噬的關鍵基因ATG5，明確線粒體自噬在鎘致線粒體丟失中的重要作用。另外一方面，控制線粒體丟失另一重要環(huán)節(jié)線粒體生成，我們也檢測了調控線粒體生成的兩個核心蛋白

5、PPARGC1A和TFAM。
　?、谠阪k暴露條件下，通過檢測L02細胞線粒體的形態(tài)來衡量分裂-融合的動態(tài)平衡明確鎘引起線粒體自噬的機制，檢測L02細胞中DNM1L、OPA1、MFN1、MFN2、FIS1等分子的表達變化，評價該調控軸的活化水平;并對DNM1L的表達進行正負調控，檢測相應的線粒體分裂-融合的動態(tài)平衡，線粒體自噬的水平以及線粒體質量的變化，驗證DNM1L在鎘引起的線粒體丟失中的作用。同時，進一步利用兩種檢測鈣水平的探針

6、，精確檢測細胞內(nèi)鈣和線粒體內(nèi)鈣水平，并對兩種鈣離子水平分別進行調控，以明確鎘是如何引起線粒體分裂-融合相關蛋白的變化的機制。
　?、垡訡57BL6/J小鼠腹腔注射可溶性鎘化合物氯化鎘(CdCl2)為實驗模型，運用DNM1L特異性抑制劑Mdivi-1進行在體干預，通過檢測ATP含量、線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ的蛋白含量研究鎘對小鼠肝臟線粒體丟失的影響。在小鼠出現(xiàn)肝臟功能改變的鎘暴露條件下，檢測DNM1L的水平和線粒體轉位情況，檢測線粒體利

7、用電鏡評價鎘對動物肝臟線粒體形態(tài)的影響，蛋白印記實驗檢測動物肝臟組織的線粒體中LC3和P62的水平，探討線粒體自噬在鎘的肝臟毒性效應中的作用;
　　研究結果:
　?、貱dCl2對L02細胞造成顯著的線粒體丟失效應，并呈現(xiàn)劑量依賴關系;鎘能夠引起線粒體質量的下降，線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ的蛋白含量線粒體DNA的拷貝數(shù)減少，從而引起細胞的能量代謝障礙，導致肝臟的細胞毒性。CdCl2暴露引起L02細胞LC3蛋白的高表達，SQSTM1蛋

8、白的降解，含有線粒體的自噬小體和含有線粒體的自噬溶酶體的高表達，巴弗洛霉素A抑制后進一步加劇了鎘引起的自噬水平，從而明確鎘能使肝臟細胞的自噬流增加。在暴露鎘的L02細胞中，抑制ATG5的表達，一定程度上緩解鎘引起的線粒體的丟失及細胞毒性;同時，介導線粒體丟失另一個重要環(huán)節(jié)，線粒體生成并沒有受到鎘的擾亂。
　　②CdCl2暴露引起L02細胞線粒體分裂-融合的動態(tài)平衡的紊亂，能夠顯著引起線粒體分裂增多，即長條形和棒狀的線粒體變成了點狀

9、或球形的線粒體;同時，在精確控制線粒體分裂-融合的5種蛋白中，鎘暴露僅上調DNM1L的表達，增多的DNM1L蛋白會進一步由胞漿向線粒體轉位;在暴露鎘的細胞中，抑制DNM1L的表達，一定程度上緩解鎘引起的過度的線粒體自噬的發(fā)生及線粒體的丟失，從而維持細胞穩(wěn)態(tài);同時，鎘暴露顯著引起細胞內(nèi)鈣和線粒體鈣水平的增高，抑制細胞內(nèi)鈣能夠成功拮抗鎘誘導的DNM1L的表達及其線粒體轉位，抑制線粒體內(nèi)鈣只能夠拮抗DNM1L的轉位。
　?、? mg C

10、d/kg的CdCl2經(jīng)腹腔暴露引起C57BL6/J小鼠在暴露7天后肝臟出現(xiàn)的線粒體丟失和肝臟能量代謝障礙;CdCl2暴露7天后，小鼠肝臟組織中檢測到明顯的分裂的線粒體和過度的線粒體自噬的發(fā)生，然而利用DNM1L蛋白特異性活性抑制劑Mdivi-1，能夠顯著扭轉小鼠肝臟中鎘引起的過度線粒體自噬，降低線粒體蛋白COXⅣ蛋白的減少，維持肝臟細胞正常的能量代謝。
　　研究結論:
　　根據(jù)本課題的研究結果，獲得以下結論:鎘通過引起線粒體

11、的丟失，影響肝臟細胞的能量代謝，從而表現(xiàn)出肝臟毒性效應;鎘引起的過度的線粒體自噬而不是損傷了線粒體的生成可能是其造成線粒體丟失和肝臟細胞毒性的重要原因;鎘暴露引起Ca2+-DNM1L“調控軸”激活，由此造成的線粒體分裂-融合的動態(tài)平衡的紊亂可能是鎘引起線粒體過度自噬的分子基礎。本研究闡述了Ca2+-DNM1L介導的線粒體自噬在鎘致線粒體丟失及其肝臟毒性中的重要作用，通過了解DNM1L介導的線粒體分裂和線粒體自噬這一信號通路，為了解鎘的肝