煙草差減cDNA文庫(kù)構(gòu)建及煙堿相關(guān)EST序列分析.pdf

1、煙堿是影響煙葉及卷煙產(chǎn)品品質(zhì)的重要物質(zhì)。為了發(fā)掘影響煙堿合成的關(guān)鍵基因，將其應(yīng)用于煙堿含量性狀的分子調(diào)控上，從而使煙堿含量能夠處于適宜的范圍。本研究通過測(cè)定不同雜交組合打頂前后的煙堿含量，篩選不同優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)的雜交組合及其親本為材料，構(gòu)建cDNA文庫(kù)；通過高通量Illumina HiseqTM測(cè)序，得到原始序列后過濾獲得干凈序列，將不同材料轉(zhuǎn)錄本的干凈序列進(jìn)行兩兩比較，找出兩者間差異表達(dá)的基因；以番茄基因組作為參照，對(duì)這些差異表達(dá)的基因進(jìn)行

2、GO功能富集，找到與煙堿合成相關(guān)的途徑，并根據(jù)KEGG Pathway分析，找出與煙堿合成相關(guān)的關(guān)鍵上調(diào)和下調(diào)基因，通過NCBI搜索，詳細(xì)掌握這些關(guān)鍵基因的信息。主要研究結(jié)果如下：
　　1、2014年配置的雜交組合G70×GDH88、Va116×巴斯瑪和NC82×TN90表現(xiàn)為超高親優(yōu)勢(shì)；G70×馬里蘭煙、G70×湄潭大蠻煙及K326×湄潭大蠻煙表現(xiàn)為超低親優(yōu)勢(shì)；G70×青梗、G70×TN90、G70×巴斯瑪、G70×GDH02、

3、K326×馬里蘭煙、K326×永勝曬煙、K326×GDH02、K326×南江三號(hào)、K326×GDH88、Val16×青梗、Va116×南江三號(hào)、Va116×GDH88、NC82×永勝曬煙和NC82×GDH88這14個(gè)雜交組合表現(xiàn)為弱優(yōu)勢(shì)。2015年在參試的10個(gè)雜交組合中，Va116×巴斯瑪、Va116×永勝曬煙煙堿含量性狀的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)一致，表現(xiàn)出正向超親優(yōu)勢(shì)。另外還有3個(gè)雜交組合Va116×TN90、Va116×GDH88及K326

4、×TN90表現(xiàn)為弱（無）優(yōu)勢(shì)。結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)篩選到強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合Va116×巴斯瑪和弱優(yōu)勢(shì)雜交組合Va116×GDH88在兩年間四個(gè)時(shí)期的雜種優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)一致，這兩個(gè)不同優(yōu)勢(shì)的雜交組合將作為后期文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)材料。
　　2、應(yīng)用Illumina HiSeqTM雙末端測(cè)序技術(shù)，按照有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程及數(shù)據(jù)分析方法，本試驗(yàn)中4個(gè)材料獲得的干凈序列片段數(shù)量均占原始序列片段數(shù)量的95％以上，錯(cuò)誤率均為0.02%，Q20均高于96%、Q

5、30均高于91%。在容許兩堿基錯(cuò)配的基礎(chǔ)上，4個(gè)材料干凈序列中，比對(duì)到參考基因組的序列數(shù)量大于80%，并且能夠在參考序列上有唯一比對(duì)位置的序列達(dá)78%以上，多個(gè)定位的測(cè)序序列占總體的百分比不超過2.5%，序列在基因組正鏈和負(fù)鏈所占的比例較為均衡。結(jié)果表明選擇的參考基因組合適，并且相關(guān)的實(shí)驗(yàn)不存在污染，所構(gòu)建的文庫(kù)質(zhì)量高，可以滿足后續(xù)的序列分析。此外，Illumina高通量測(cè)序是有效獲得煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的方法。
　　3、4個(gè)實(shí)驗(yàn)材料的

6、轉(zhuǎn)錄組序列比對(duì)到基因組上，均表現(xiàn)為定位到外顯子的序列數(shù)量最多，且高達(dá)85%以上，2%左右的干凈序列定位在內(nèi)含子上，其余序列比對(duì)到基因區(qū)間。結(jié)果說明4個(gè)轉(zhuǎn)錄本在參考基因組的注釋較為完全，文庫(kù)的準(zhǔn)確度較高，有利于后續(xù)尋找差異表達(dá)的基因。
　　4、基于FPKM法，在Va116×巴斯瑪與Va116兩個(gè)材料之間，共找到差異表達(dá)基因4119個(gè)，其中上調(diào)基因2224個(gè)，下調(diào)基因1895。Va116×巴斯瑪與其父本巴斯瑪相比較，共找到差異表達(dá)基因

7、1109個(gè)，其中上調(diào)基因537個(gè)，下調(diào)基因572個(gè)。Va116×巴斯瑪與Va116×GDH88兩個(gè)樣本間，共找到差異表達(dá)基因2119個(gè)，其中上調(diào)基因1338個(gè)，下調(diào)基因781個(gè)。結(jié)果表明不同優(yōu)勢(shì)的雜交組合以及強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合與其親本之間存在大量差異表達(dá)的基因。
　　5、通過分析三個(gè)比較組合差異表達(dá)基因的GO富集情況，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因大部分與生物學(xué)過程有關(guān)。在生物學(xué)過程中，差異表達(dá)基因在代謝過程和生化過程所占的比例較大，在與煙堿合成相

8、關(guān)的代謝過程所占的比例較少，但是富集程度達(dá)到顯著。分子功能的GO分類中，差異基因在催化活性所占的比例較大。在差異基因顯著富集的GO term中，上調(diào)和下調(diào)基因的分布由于分類的不同有不同的表現(xiàn)，其中與煙堿合成有關(guān)的三個(gè)生物學(xué)過程差異表達(dá)基因表現(xiàn)為上調(diào)基因比下調(diào)基因的數(shù)量多。結(jié)果說明不同材料間，在生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)方面均存在差異表達(dá)的基因，這些差異基因有可能是造成某些性狀產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)的原因。
　　6、通過三個(gè)比較組合差

9、異表達(dá)基因的KEGG通路分析，找到兩條與煙堿合成有關(guān)的代謝途徑，分別是莨菪烷類、哌啶、吡啶生物堿合成和煙酸和煙酰胺代謝，發(fā)現(xiàn)天門冬氨酸氧化酶、喹啉酸合酶、喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(脫羧)、胺氧化酶（含銅）、煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和兩個(gè)未鑒定的蛋白參與煙堿生物合成，涉及16個(gè)與煙堿合成相關(guān)的酶基因，其中有12個(gè)為上調(diào)基因，促進(jìn)煙堿合成，3個(gè)為下調(diào)基因，抑制煙堿合成，還有1個(gè)酶基因既表現(xiàn)上調(diào)也表現(xiàn)下調(diào)。通過NCBI搜索，該16個(gè)與煙堿合成相關(guān)的關(guān)