椪柑花器官和幼果的cDNA文庫(kù)構(gòu)建及EST分析.pdf

1、以cDNA文庫(kù)為基礎(chǔ)的ESTs(Expressed Sequence Tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)技術(shù)是一種快速進(jìn)行基因功能分析及發(fā)現(xiàn)新基因的方法。為了開(kāi)展我國(guó)特色椪柑的基因發(fā)掘研究，本文構(gòu)建了椪柑花和幼果的cDNA文庫(kù)，并以該文庫(kù)為材料進(jìn)行5'端EST測(cè)序和生物信息學(xué)分析。主要結(jié)果如下：
　　 1、以改良的異硫氰酸胍法從椪柑花和幼果中提取總RNA，分離純化富含PolyA的mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，通過(guò)CHROMA

2、S PIN-400柱篩選出其中大于500bp的片段與載體pDNR-LIB連接，最后用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌ElectroMAXDH5a，構(gòu)建了椪柑花和幼果的cDNA文庫(kù)。經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，初級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容為1.13×108個(gè)/mL，符合高質(zhì)量文庫(kù)的要求。文庫(kù)的重組率為97％，且插入片段的長(zhǎng)度在0.5-2.5kb之間，說(shuō)明文庫(kù)完整、有效，可用于大規(guī)模EST序列測(cè)定及數(shù)據(jù)分析。
　　 2、從椪柑花和幼果cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中隨機(jī)選取503個(gè)克隆進(jìn)行

3、測(cè)序，經(jīng)CAP3軟件編輯后，獲得長(zhǎng)度大于100bp的有效序列為487條，其序列的平均長(zhǎng)度為522bp，序列平均質(zhì)量數(shù)為36.25；另外通過(guò)GC含量分析獲得EST的GC含量為40.49％。利用CAP3軟件對(duì)487條有效EST序列進(jìn)行片段重疊群分析和拼接后共獲得298個(gè)獨(dú)立基因(Unigene)，其中包括27個(gè)片段重疊群(Contig)和271個(gè)獨(dú)立的ESTs(Singlet)。
　　 3、將獨(dú)立基因(Unigene)以GeneOn

4、tology進(jìn)行功能分類。按照GO的分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組分三個(gè)不同分類角度分類，把通過(guò)BlastX比對(duì)獲得椪柑有功能描述基因(包括功能確定的及推測(cè)功能的)分為11類，即代謝相關(guān)基因(Metabolism)占功能描述基因的21.02％、蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因(Protein synthesis)占功能描述基因的19.89％、能量代謝相關(guān)基因(Energy)占8.52％、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)基因(Transporters)占9.09％、轉(zhuǎn)錄相關(guān)

5、基因(Transcription)占14.20％、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(Cellular signal transduction)占4.55％、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因(Cell growth anddivision)占3.98％、細(xì)胞抗性及防御相關(guān)基因(Disease and defence)占8.52％、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因(Cell structure and Cellcycle)占3.41％、次生代謝相關(guān)基因(Secondarymetabo