海7124纖維-胚珠cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、測(cè)序及EST分析.pdf

1、棉花作為纖維的重要來源，是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在世界經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要的作用。cDNA文庫(kù)構(gòu)建和篩選是基因克隆的重要方法之一，它是目前發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基本工具，從cDNA文庫(kù)中可以篩選到目的基因，并直接用于該基因的表達(dá)。本研究中構(gòu)建了海7124-3到6DPA胚珠(含纖維)的cDNA文庫(kù)，并從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取了1萬(wàn)多個(gè)單克隆進(jìn)行5'端測(cè)序，得到了EST序列，并對(duì)EST序列進(jìn)行功能預(yù)測(cè)與代謝分析、EST- SSR分析、定位及作

2、圖。 1.海7124 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及隨機(jī)測(cè)序 利用clontech公司的SMART技術(shù)構(gòu)建了海島棉海7124-3～6DPA的胚珠(含纖維)的cDNA文庫(kù)，從構(gòu)建的海7124 cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取了11，970個(gè)單克隆使用載體上的通用引物T7進(jìn)行5'端測(cè)序，獲得9，034條序列，利用chromas軟件對(duì)測(cè)序得到的序列進(jìn)行分析，一共獲得8，783條＞500bp序列。使用Cap3程序?qū)?jīng)過分析后的序列進(jìn)行拼接，獲得3，

3、505條Unigenes。 將3，505條Unigenes分別與網(wǎng)上下載的陸地棉TM-1數(shù)據(jù)庫(kù)中的32，190條EST序列進(jìn)行BLASTn分析序列相似性，E-value＜le-100，其中有1，110(31.67％)條EST在TM-1數(shù)據(jù)庫(kù)中能找到相似性的序列，有2，395(68.33％)條在TM-1中找不到相似性的序列；再與網(wǎng)上下載的棉花的所有EST序列共281，233條進(jìn)行BLASTn分析序列相似性，E-value＜le-1

4、00，其中有3173(90.53％)條EST在棉花所有EST序列數(shù)據(jù)庫(kù)中能找到相似性的序列，有332(9.47％)條在棉花所有EST序列中找不到相似性的序列。 2.Unigenes的功能分析和代謝分析 將獲得3，505條Unigenes利用BLAST2GO在線軟件進(jìn)行功能分析和代謝分析，結(jié)果顯示，在代謝途徑分析中，有1574條(44.9％)EST有代謝途徑的，其中碳水化合物代謝(314，19.9％)最多，其次是氨基酸代謝

5、(246，15.6％)；在功能分析中，將已知功能的EST按照細(xì)胞組分、分子功能和生物進(jìn)程分為三大類，在細(xì)胞組分一類中，大多數(shù)被歸類為細(xì)胞(cell，59％)和細(xì)胞器(organelle，26％)兩類；在分子功能的分類中，結(jié)合(binding.41％)和催化活性(catalytic activity，37％)居多；在生物進(jìn)程的分類中，分為細(xì)胞進(jìn)程(cellular process，30％)和代謝進(jìn)程(metabolic process，2

6、6％)的比較多。 3.EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)及定位 將這3，505條Unigenes應(yīng)用于EST-SSR分析，利用AutoSSR軟件的分析獲得了191條(11.38％)含SSR的序列，其中包含有208個(gè)SSR，利用primer3在線對(duì)這191條EST序列中設(shè)計(jì)了52對(duì)SSR引物，首先對(duì)作圖群體的親本TM-1和海7124進(jìn)行引物的篩選，檢測(cè)設(shè)計(jì)引物的多態(tài)性，獲得了23對(duì)有多態(tài)性的SSR引物，將有多態(tài)性的SSR引物再檢測(cè)它