應(yīng)用Ussing-chamber連續(xù)灌注系統(tǒng)對(duì)人眼睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究.pdf

1、青光眼是第二位的不可逆性致盲眼病，因青光眼而致盲的患者數(shù)以百萬計(jì)，青光眼給個(gè)人、家庭和社會(huì)均帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和社會(huì)生產(chǎn)力的發(fā)展，因此青光眼的防治研究具有其迫切性，并具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。青光眼的基本病理機(jī)制是眼壓的病理性升高導(dǎo)致視神經(jīng)乳頭損害和視野的缺損，目前認(rèn)為青光眼治療是通過各種治療手段降低眼壓、保護(hù)患者殘存的視功能，以達(dá)到視神經(jīng)保護(hù)的目的。因此降眼壓治療是青光眼最重要的治療手段。房水的生成及排出的動(dòng)

2、態(tài)平衡是影響眼壓的最重要因素，目前藥物治療是最有效的直接抑制房水生成及/或促進(jìn)房水排出的降眼壓治療方法，是減緩青光眼致盲的發(fā)生及發(fā)展的重要干預(yù)治療手段。正常生理狀態(tài)下房水分泌具有晝夜節(jié)律性，夜晚睡眠狀態(tài)房水分泌明顯減少(50％～60％)，而青光眼患者的房水分泌晝夜特性則恰恰與之相反，夜晚睡眠狀態(tài)房水生成明顯增加，房水生成的晝夜特性與眼壓的調(diào)控及青光眼患者視神經(jīng)、視野損害之間具有極其密切的聯(lián)系，因此對(duì)正常人眼睫狀體離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究及房水

3、分泌機(jī)制的研究是很有必要的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所得到的結(jié)果表明，房水是由睫狀體上皮(ciliaryepithelium，CE)兩層細(xì)胞即色素上皮(pigmentedepithelium，PE)和非色素上皮(non-pigmentedepithelium，NPE)細(xì)胞組成的合胞體功能單位所分泌，PE細(xì)胞面向睫狀體血液側(cè)而NPE細(xì)胞則面向睫狀體的房水側(cè)，兩層細(xì)胞與頂膜相連，之間為大量的縫隙連接(gapjunctions，GJ)。在房水分泌的過程中Na

4、+、Cl-的攝取及分泌是關(guān)鍵，其中Na+,K+-ATP酶是主動(dòng)的離子的能源系統(tǒng)。PE細(xì)胞可能通過Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體(cotransporter)或Cl--HCO3-及Na+-H+交換器(exchanger)從血液側(cè)攝取Na+及Cl-，再通過可自由交換離子的縫隙連接從PE細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到NPE細(xì)胞，NPE細(xì)胞則通過Cl-離子通道或Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體釋放Na+及Cl-到后房形成房水。由于不同種屬之間房水的成分及離子轉(zhuǎn)運(yùn)

5、的機(jī)制不同，其房水分泌的機(jī)制可能不同，且目前國內(nèi)外尚未見有對(duì)人眼睫狀體上皮合胞體完整功能單位的系統(tǒng)研究，因此很有必要對(duì)人眼睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，以期闡明人眼睫狀體上皮房水分泌機(jī)制與眼壓調(diào)控機(jī)制之間的關(guān)系，為青光眼患者的眼壓調(diào)控機(jī)制的研究及青光眼治療靶眼壓的確定奠定理論基礎(chǔ)，并為青光眼患者的藥物治療提供有效、毒副作用低微的藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)。 目的 研究離體人眼睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)制，

6、闡明人眼睫狀體房水分泌的機(jī)制與眼壓調(diào)控機(jī)制之間的關(guān)系，為青光眼患者眼壓調(diào)控機(jī)制的研究及青光眼治療靶眼壓的確定奠定理論基礎(chǔ)，并為青光眼患者的藥物治療提供有效、毒副作用低微藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。 方法 采用改良的Ussing-chamber連續(xù)灌注系統(tǒng)電生理檢測(cè)方法，對(duì)新鮮離體的人眼睫狀體上皮進(jìn)行電參數(shù)的測(cè)量，并應(yīng)用不同離子濃度液體替代、Na+,K+-ATP酶阻滯劑、Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑、Cl-通道阻滯劑

7、及縫隙連接阻滯劑等對(duì)睫狀體血液側(cè)和/或房水側(cè)進(jìn)行灌注，觀察這些藥物對(duì)人眼睫狀體上皮電參數(shù)的影響。 結(jié)果 1.73個(gè)可用資料標(biāo)本中房水側(cè)電極性為正性者41個(gè)，房水側(cè)電極性為負(fù)性者32個(gè)；房水側(cè)為正性電位差(potentialdifference，PD)者其PD、短路電流(short-circuitcurrent，SCC)及電阻(resistance，R)分別為：0.56±0.06mV、12.03±1.26μA/cm2及48

8、.0±1.7Ωcm2；房水側(cè)為負(fù)性PD者其PD、SCC及R分別為：-0.40±0.05mV、-9.83±1.14μA/cm2及46.6±1.7Ωcm2。房水側(cè)電極性與標(biāo)本獲取的時(shí)間之間無關(guān)聯(lián)。當(dāng)房水側(cè)為負(fù)性時(shí)，PD及SCC的極性均依賴于灌注液中的Cl-濃度，Cl-濃度下降到60mM時(shí)PD及SCC的極性逆轉(zhuǎn)。 2.所有睫狀體標(biāo)本均對(duì)哇巴因(ouabain)有反應(yīng)，起作用時(shí)間快(1分鐘)。當(dāng)PD為負(fù)性時(shí)，先發(fā)生超極化，待達(dá)到最大值后

9、則去極化。當(dāng)PD是正性時(shí)，很快發(fā)生超極化，但不再發(fā)生去極化。 3.當(dāng)PD為正性時(shí)，不論布美他尼(bumetanide，BMT)加入到房水側(cè)或血液側(cè)均能引起明顯的抑制作用，使睫狀體上皮PD及SCC抑制，抑制率在血液側(cè)分別為83％及85％，在房水側(cè)分別為54％及60％。當(dāng)PD為負(fù)性時(shí)，BMT加入到血液側(cè)對(duì)電參數(shù)無作用，加入到房水側(cè)則引起超極化刺激作用。 4.不論P(yáng)D為正性或負(fù)性，尼氟滅酸(niflumicacid，NFA)及

10、苯甲酸[5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoicacid，NPPB]均先引起超極化，然后再去極，使PD及SCC被抑制，。4,4'-二硝基二苯乙烯-2，2’-二磺酸鈉(4，4'-dinitrostilbene-2,2'-disulfonicacid，DNDS)在血液側(cè)或房水側(cè)均對(duì)睫狀體電參數(shù)無明顯的影響作用。 5.雙側(cè)應(yīng)用3.5mM的庚醇(heptanol)，當(dāng)PD為正性時(shí)先是小的去極化，然后

11、是明顯的超極化作用；當(dāng)PD為負(fù)性時(shí)則先有一小的超極化，然后是同樣幅度的去極化并回復(fù)到原有的基線水平。 結(jié)論 1.離體人眼睫狀體上皮組織長時(shí)間內(nèi)(4～6小時(shí))可以維持其活性，可以應(yīng)用于跨睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)研究。 2.人眼跨睫狀體上皮電位差PD可表現(xiàn)為房水側(cè)正性或負(fù)性，與睫狀體組織離體的時(shí)間無相關(guān)性。房水側(cè)PD極性依賴于細(xì)胞外Cl-的濃度，Cl-可能是人眼睫狀體上皮跨膜電位產(chǎn)生的重要成分。 3.Ouabain

12、可阻斷人眼睫狀體上皮PE及NPE細(xì)胞上的Na+，K+-ATP酶，引起跨睫狀體上皮電參數(shù)的改變，Na+，K+-ATP酶在維持睫狀體上皮跨膜電位差起重要作用。當(dāng)房水側(cè)PD為正性時(shí)，睫狀體上皮跨上皮的電位差可能由Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)占主導(dǎo)地位。 4.BMT可明顯抑制人眼睫狀體上皮PD及SCC，且以血液側(cè)的抑制作用更大。Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體可能存在于人眼睫狀體上皮的PE及NPE細(xì)胞上，其PE細(xì)胞攝取Na+及Cl-的方式可能是，至少大

13、部分是通過Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體來實(shí)現(xiàn)的。 5.DNDS在血液側(cè)對(duì)人眼睫狀體上皮電參數(shù)無影響，提示Cl--HCO3-交換器可能不是人眼睫狀體上皮PE細(xì)胞攝取Cl-的主要方式。 6.heptanol對(duì)人眼睫狀體上皮電參數(shù)的影響提示縫隙連接是睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。 7.NFA及NPPB對(duì)人眼睫狀體上皮電參數(shù)的抑制作用，提示Cl-通道可能存在于人眼睫狀體上皮NPE細(xì)胞上，并在睫狀體上皮離子轉(zhuǎn)運(yùn)中起