基因修飾人胚神經(jīng)干細(xì)胞促進兔脊髓損傷修復(fù)的實驗研究.pdf

1、脊髓損傷(SCI)所致的完全性截癱，臨床至今尚無有效的治療藥物或手段。SCI的治療和修復(fù)，目前仍是一個難以解決的世界性難題。研究表明，SCI后神經(jīng)不能再生，關(guān)鍵是缺乏具有生長潛能的神經(jīng)細(xì)胞和能促進神經(jīng)纖維再生的合適微環(huán)境。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為SCI的修復(fù)和治療帶來新的希望。神經(jīng)干細(xì)胞是一種具有生長和分化潛能的神經(jīng)祖細(xì)胞，能進行分裂增殖和自我更新，在適宜的條件下能夠分化為各種神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的自身特點決定了它可以作為神經(jīng)移植的理想材料和

2、基因治療的理想載體。SCI后移植神經(jīng)干細(xì)胞，不僅起到支架、營養(yǎng)作用，也能補充、替代缺失的神經(jīng)細(xì)胞，還能分泌調(diào)節(jié)因子改善神經(jīng)再生的微環(huán)境；與基因治療相結(jié)合，把神經(jīng)細(xì)胞作為基因治療的載體細(xì)胞，替代的同時表達和分泌特定的目的基因產(chǎn)物，就可以提供一種更理想的微環(huán)境，刺激神經(jīng)的生長。本實驗第一部分進行了鼠胚與人胚神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，并證實其具有自我更新與多分化潛能。本實驗第二部分進行了人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的提取，并利用逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體

3、PLEGFP構(gòu)建了BDNF-PLEGFP質(zhì)粒。因技術(shù)原因，未能生產(chǎn)出大量可用于轉(zhuǎn)染的BDNF-PLEGFP病毒。然后利用PLEGFP質(zhì)粒生產(chǎn)出大量攜帶EGFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，并將其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，使神經(jīng)干細(xì)胞表達EGFP蛋白，并在熒光顯微鏡下直接觀察到較強的黃綠色熒光。本實驗第三部分制作了兔T9脊髓全橫斷模型，并移植經(jīng)基因修飾表達EGFP的人胚神經(jīng)干細(xì)胞，從形態(tài)結(jié)構(gòu)、遷移分化模式及神經(jīng)功能恢復(fù)等方面觀察人胚神經(jīng)干細(xì)胞移植對脊髓損

4、傷后神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù)的作用并探討其作用機制，為人胚神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 第一部分鼠胚與人胚神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)目的：從胎鼠與人工流產(chǎn)胚腦皮層分離神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，經(jīng)克隆及長期培養(yǎng)建立NSCs株并觀察其生物學(xué)特性。方法：分離孕14天大鼠與10-20周人胚腦皮層來源的NSCs并連續(xù)傳代培養(yǎng)，通過克隆試驗、生長曲線觀察、誘導(dǎo)分化實驗及免疫組織 TransplantationofGeneti