BMP-7基因修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠下頜牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牽張成骨(distractionosteogenesis，DO)是蘇聯(lián)學(xué)者Ilizarov逐步建立起來的一項矯形外科領(lǐng)域的新技術(shù)，目前已被廣泛用于四肢不對稱畸形、以及許多作為一種內(nèi)源性組織工程技術(shù)(endogenoustissueengineering)，該方法與傳統(tǒng)矯形手術(shù)比較具有諸多優(yōu)勢；但DO中較長的固定期，以及一些特殊情況下產(chǎn)生的牽張骨痂纖維愈合、甚至不愈，仍然是阻礙其臨床廣泛應(yīng)用的主要弊端。 目前，許多方法被嘗試用于促

2、進(jìn)牽張骨痂形成，縮短DO固定期；這些方法包括應(yīng)用低頻超聲波、直流電或電磁場刺激、高壓氧治療、系統(tǒng)應(yīng)用生長激素、以及局部應(yīng)用生長因子等。部分方法獲得了一定的效果，然而所有上述手段均未獲得廣泛的臨床應(yīng)用。 雖然許多生長因子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)在骨生長和修復(fù)中對骨再生具有重要的調(diào)節(jié)作用，骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)在其中是骨再生能力最強(qiáng)的因子。BMPs屬TGF-B超家族成員，通過細(xì)胞膜表面特

3、異的Ⅰ/Ⅱ型受體以及胞內(nèi)Smads信號級聯(lián)來發(fā)揮作用。BMPs局部基因治療已被廣泛用于組織工程中骨/軟骨缺損的修復(fù)再造，并獲得了諸多的進(jìn)展。最近一些研究表明，在牽張間隙內(nèi)有BMPs的特異時空表達(dá)，提示BMPs可能在DO骨再生中發(fā)揮著與骨/軟骨組織工程中相同的重要作用。然而，BMPs2蛋白在體內(nèi)容易擴(kuò)散、生物活性半衰期短，因而直接應(yīng)用難以發(fā)揮最佳的效果；以前應(yīng)用該方法促進(jìn)牽張成骨，效果并不理想，得出的研究結(jié)論也很不一致。BMPs局部基因治

4、療，則可誘導(dǎo)BMPs在治療部位較長時間內(nèi)以較高的水平表達(dá)，因而可避免直接應(yīng)用BMPs蛋白的缺陷，獲得更好的預(yù)期效果。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一群具有多向分化潛能的細(xì)胞，在體內(nèi)、體外均具有向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化的能力；因而被廣泛用于組織工程和基因工程中骨與軟骨組織缺損的再造。以MSCs為細(xì)胞載體的BMPsexvivo基因治療，不僅可保證BMPs的穩(wěn)定表達(dá)，而且可為骨再生提供足夠

5、數(shù)量的骨形成細(xì)胞；因而MSCs是BMPs基因治療促進(jìn)牽張成骨骨痂形成的最佳細(xì)胞載體。 基于上述認(rèn)識，本研究擬探索一條全新的促進(jìn)大鼠下頜牽張成骨的策略，即應(yīng)用BMP-7基因修飾的自體骨髓MSCs體內(nèi)移植來促進(jìn)牽張骨痂形成。據(jù)我們所知，這是國際上首次報道采用BMPexvivo基因治療策略來促進(jìn)牽張成骨中骨痂形成。在本研究中，首先建立大鼠下頜牽張成骨模型，并體外構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-BMP7；隨后應(yīng)用重組質(zhì)粒pEGFP-BMP7瞬時

6、轉(zhuǎn)染大鼠自體MSCs，將BMP-7修飾的MSCs進(jìn)一步導(dǎo)入到大鼠下頜牽張間隙中；應(yīng)用影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計量學(xué)等手段評價BMP-7局部基因治療促進(jìn)牽張成骨的效果，并檢測BMP-7體內(nèi)表達(dá)情況。本研究結(jié)果將為臨床上應(yīng)用BMP-7基因治療促進(jìn)牽張成骨提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本研究結(jié)果及提示： 1.通過從下頜升支前緣中點(diǎn)到下頜下緣進(jìn)行骨切開，成功建立了大鼠下頜牽張成骨模型，并為影像學(xué)、組織學(xué)檢測所證實(shí)； 2.應(yīng)用密度

7、梯度離心法成功分離了大鼠骨髓MSCs，并在成骨添加劑下體外向成骨細(xì)胞定向分化，表達(dá)高水平的堿性磷酸酶(ALP)活性，礦化細(xì)胞外基質(zhì)，形成礦化結(jié)節(jié)； 33.通過基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-BMP7；應(yīng)用其瞬時轉(zhuǎn)染骨髓MSCs，BMP-7表達(dá)可持續(xù)4周，最高表達(dá)在2周內(nèi)； 4.影像學(xué)、組織學(xué)、組織形態(tài)計量學(xué)檢測表明，BMP-7基因修飾的自體骨髓MSCs可有效促進(jìn)大鼠下頜牽張骨痂形成，縮短DO固定期； 5