Hath6調(diào)控內(nèi)皮細胞分化與功能及其作用機制研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植是治療四肢缺血和心血管疾病的新策略。骨髓來源的單個核細胞、血液來源的祖細胞、間充質(zhì)干細胞及胚胎干細胞都可以作為誘導內(nèi)皮細胞(endothelial cells,ECs)的種子細胞。由于胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)可以在體外條件下模擬胚胎發(fā)育的過程,用于關鍵信號通路及調(diào)控分子的研究,進而受到越來越多的關注。目前,人胚胎干

2、細胞(human embryonic stem cells,hESCs)向ECs誘導分化主要有三種策略,即添加生長因子、低氧及層流剪切力(laminar shear stress,LSS)的誘導。大量文獻報道表明添加重組人內(nèi)皮細胞生長因子(recombinant human vascular endothelial growth factor,rhVEGF)、重組人堿性成纖維細胞生長因子(recombined human basic f

3、ibroblast growth factor,rhbFGF)等生長因子及低氧誘導因子HIF1α可以調(diào)控hESCs向ECs的誘導分化。但是對LSS作用機制的研究并不是很多。LSS在體內(nèi)條件下,主要是指血液在血管中流動時對血管壁產(chǎn)生的沖擊力。ECs作為襯貼于血管內(nèi)腔面的單層扁平細胞會響應血流的刺激發(fā)揮對血管的調(diào)控作用,包括對血管收縮和舒張的調(diào)節(jié)。ECs對血流刺激的響應就是對LSS的響應。已經(jīng)有文獻報道表明LSS在促進ECs分化及ECs功能

4、調(diào)控過程中都發(fā)揮了重要作用。
　　人atonal同源基因6(human atonal homologue 6,Hath6)是在使用LSS處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)檢測基因表達變化時被發(fā)現(xiàn)的。LSS處理后,Hath6的表達明顯上調(diào)。初步的研究結果表明Hath6是ECs選擇性表達的堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,

5、bHLH)轉錄因子,該轉錄因子家族成員在細胞的分化及胚胎發(fā)育形成中都有重要的調(diào)控作用。不僅如此,Hath6在人類一些高度血管化的組織中高表達,這提示Hath6作為ECs中響應LSS的轉錄因子,其有可能參與到血管的發(fā)生及調(diào)控中。LSS對ECs的分化及功能調(diào)控有重要作用,Hath6作為ECs中響應LSS的轉錄因子,這些進一步提示Hath6有可能參與到ECs的分化及功能調(diào)控中。
　　為了驗證我們的假設,在本課題中我們模擬LSS處理細胞,

6、檢測Hath6的表達變化;進一步建立過表達及下調(diào)表達Hath6的hESCs及ECs并在此基礎上展開Hath6對ECs分化、功能調(diào)控及其作用機制的研究。
　　首先,為研究Hath6對ECs誘導分化的影響,我們建立了一套hESCs起始向ECs誘導分化的三階段誘導體系。在分階段誘導分化的過程中,在誘導分化的第二階段檢測到內(nèi)皮相關表面標志——CD31、KDR和VE-cadherin的比例可以分別到達約16％、60%和10%,進一步功能的檢

7、測發(fā)現(xiàn),該誘導分化階段的細胞可以形成血管樣結構,結合植物凝集素。進一步的誘導分化不僅僅可以獲得更大量的細胞并且所得CD31單陽性細胞的比例進一步提高至30%以上,同時細胞具備吞噬LDL的能力。上述實驗結果表明我們建立了一套二維培養(yǎng)條件下,無血清、成分明確的ECs誘導分化體系,這是我們開展下游研究工作的基礎。
　　其次,我們利用Q-PCR檢測到hESCs自主分化及分階段誘導內(nèi)皮分化的過程中,內(nèi)源性Hath6的表達呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢,

8、與內(nèi)皮特異性基因的上調(diào)表達呈正相關,這和我們的假設相一致。之后我們使用建立的過表達及下調(diào)表達Hath6的hESCs進行ECs的定向誘導分化,觀察Hath6的表達變化對內(nèi)皮分化的影響。Q-PCR的結果表明,同對照組相比,Hath6的過表達明顯上調(diào)了內(nèi)皮相關基因的表達,基因上調(diào)幅度均超過3倍;流式檢測的結果表明,Hath6的過表達促進了CD31+、KDR+及CD31+/KDR+細胞亞群比例,統(tǒng)計分析的數(shù)據(jù)表明Hath6的過表達顯著提高了上述

9、細胞亞群比例約1.5倍并且差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05);血管樣結構形成實驗的結果表明,Hath6的過表達顯著促進了血管樣結構的形成及Dil-Ac-LDL的吞噬。這些結果都表明Hath6的過表達可以顯著促進ECs的分化。在Hath6下調(diào)表達組的實驗中,我們檢測到Hath6的下調(diào)表達明顯抑制了內(nèi)皮相關基因在mRNA及蛋白水平的表達,也明顯抑制了血管樣結構的形成和Dil-Ac-LDL的吞噬。這些結果表明Hath6對ECs的分化是必須的。

10、綜上所述,我們認為Hath6調(diào)控了ECs的分化。
　　再次,我們對Hath6是否能夠調(diào)控ECs的功能進行了驗證。在建立了過表達及下調(diào)表達Hath6的ECs后,我們首先通過RT-PCR實驗檢測到,Hath6的過表達促進了成熟ECs中內(nèi)皮相關基因的表達,該結果證明Hath6對其它內(nèi)皮基因的表達有調(diào)控作用。隨后我們通過血管樣結構形成實驗證實在成熟的ECs中,Hath6的過表達并不能夠明顯的促進血管樣結構的形成,細胞增殖實驗檢測Hath6

11、的過表達會明顯抑制ECs的增殖。我們又進一步驗證Hath6的過表達對細胞遷移的影響,結合Hath6對增殖的明顯抑制作用,認為其過表達可以促進細胞的遷移。在Hath6下調(diào)表達組的實驗中,檢測到Hath6的下調(diào)表達會抑制內(nèi)皮相關基因的表達,明顯抑制血管樣結構的形成(p<0.05),促進細胞的增殖并抑制細胞的遷移。這些結果都表明,Hath6促進了ECs的終末成熟。
　　最后,在明確了Hath6對ECs的分化及功能調(diào)控作用后,我們開始思考

12、Hath6的作用機制。Hath6作為響應LSS的轉錄因子,可能在響應LSS后通過調(diào)控基因的表達變化實現(xiàn)其對內(nèi)皮功能的調(diào)控作用。推測作為Hath6下游的靶分子應該也會響應LSS,進一步發(fā)生表達水平的改變實現(xiàn)對ECs分化及功能的調(diào)控作用。此外,Hath6屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族成員,該家族成員通常通過結合靶基因啟動子區(qū)域的E-box序列發(fā)揮轉錄調(diào)控作用,因此確定啟動子區(qū)域的E-box也成為我們判斷Hath6靶基因的標準之一。基于

13、上述三個特點,我們初步篩選eNOS為Hath6的靶基因。有研究表明LSS處理后eNOS表達上調(diào),并且其通過調(diào)控NO的產(chǎn)生對ECs的分化及功能調(diào)控都重要作用,最關鍵的一點是生物信息學的分析數(shù)據(jù)表明,eNOS基因上游啟動子區(qū)域包含大量的E-box序列。因此在本部分的研究中,我們以eNOS為切入點展開Hath6作用機制的研究。首先我們使用LSS分別處理HUVECs及hESCs,檢測到LSS處理后Hath6和eNOS在mRNA水平的表達均發(fā)生明

14、顯上調(diào),HUVECs中分別上調(diào)6.2倍(p<0.001)和2.8倍(p<0.01);hESCs中LSS處理8h后,Hath6的mRNA表達水平上調(diào)了3.6倍(p<0.05),LSS處理20h后上調(diào)至6.1倍(p<0.05),呈現(xiàn)明顯的LSS處理時間依賴效應。之后通過Westernblot驗證了上調(diào)及下調(diào)表達Hath6的ECs及hESCs-ECs誘導分化過程中eNOS的表達變化是受Hath6調(diào)控的,進一步使用eNOS小分子抑制劑——L-N

15、AME驗證在Hath6-hESCs-ECs誘導分化體系中,添加L-NAME會明顯降低由Hath6的過表達所致的內(nèi)皮誘導分化效率的提高,最后使用LSS處理sh-Hath6-hESCs檢測到同對照組相比,sh-Hath6-hESCs中eNOS的表達也被明顯下調(diào)(p<0.001),這說明Hath6的下調(diào)表達降低了eNOS對LSS的響應。以上結果證明,Hath6作為響應LSS的轉錄因子,通過調(diào)控eNOS的表達水平進一步調(diào)控eNOS信號通路,實現(xiàn)

16、其對ECs誘導分化及功能的調(diào)控作用。
　　綜上所述,Hath6的過表達對以hESCs為起始向ECs的誘導分化有明顯的促進作用,其下調(diào)表達會明顯抑制該過程的發(fā)生;在成熟的ECs中,Hath6可以調(diào)控ECs的功能;進一步作用機制的研究結果表明,Hath6作為轉錄因子通過調(diào)控eNOS的表達進而活化下游信號通路,實現(xiàn)其對ECs分化及功能的調(diào)控。當前,對LSS調(diào)控內(nèi)皮分化及功能的作用機理研究的并不透徹,而對Hath6的研究為進一步深入理解L