ADAR1缺失損傷內皮細胞功能及其機制研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們生活水平的提高，我國居民心血管疾病的發(fā)病率顯著增加。血管內皮細胞是指襯于整個血管系統(tǒng)內表面的單層上皮細胞，它不但是血管壁與血液的天然屏障，更具有維持循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的功能。重大的心血管疾?。ㄈ绺哐獕?、冠心病等）都與血管內皮細胞調控功能障礙和損傷相關。因此，闡明血管內皮細胞功能障礙的機制對于防治重大心血管疾病具有重要意義。
　　RNA腺苷脫氨酶(Adenosine deaminases that act o

2、n RNA，ADAR)是能將RNA中腺苷酸(Adenosine)轉變?yōu)榇吸S嘌呤核苷(Inosine)的RNA A-Ⅰ編輯酶。ADAR1是哺乳動物細胞中具有編輯酶活性的脫氨酶之一，它已經被證明在胚胎發(fā)育、病毒感染、腫瘤的發(fā)生以及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。許多具有重要生理功能的蛋白質都受到RNA A-Ⅰ編輯的調控，但目前關于ADAR1對內皮細胞功能的影響及其機制尚不明了。ADAR1基因敲除小鼠胚胎呈白色、血管樣結構減少，提示A

3、DAR1敲除影響小鼠胚胎血管發(fā)育。然而，ADAR1如何影響內皮功能缺乏深入的研究，其具體分子機制有待闡明。
　　研究目的：
　　本課題以ADAR1為中心，試圖闡明ADAR1缺失對內皮細胞功能改變的影響及其機制。我們推測內皮細胞ADAR1對于維持血管內皮穩(wěn)態(tài)是不可或缺的。
　　1.在體外利用siRNA干擾內皮細胞ADAR1表達，檢測與分析內皮細胞小管形成、細胞滲透性以及內皮細胞相關功能蛋白質的表達水平，探索ADAR1對內

4、皮細胞功能的影響及其機制。
　　2.觀察血管內皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠表型，檢測條件性敲除小鼠血管滲透性和血管新生功能，初步探討ADAR1對血管內皮功能的影響，以了解ADAR1對于血管穩(wěn)態(tài)維持的重要作用及其調控機制。
　　研究方法：
　　利用ADAR1 flox/flox小鼠和VE-Cadherin-Cre小鼠雜交培育生成ADAR1flox/flox, Cre/+小鼠，即內皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠;

5、 ADAR1 flox/flox, Cre/-小鼠作為野生型對照小鼠。體外細胞實驗利用ADAR1siRNA干擾人臍靜脈內皮細胞(Human umbilicalvein endothelial cells，HUVECs)作為ADAR1基因沉默細胞模型。應用H&E染色、免疫組織化學法、免疫熒光法和透射電鏡觀察內皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠病理學改變;應用伊文氏蘭(Evans blue，EB)滲透性方法評估細胞和小鼠血管ADAR1缺失后

6、滲透性變化;應用下肢缺血模型和主動脈環(huán)血管生成實驗評價內皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠血管新生功能;應用Western Blot法和細胞免疫熒光法檢測ADAR1缺失后內皮細胞功能相關蛋白表達水平的變化。
　　研究結果：
　　1.通過ADAR1 siRNA基因沉默HUVECs ADAR1表達觀察其對內皮細胞功能的影響。結果表明與對照siRNA相比，ADAR1siRNA顯著抑制HUVECs增殖、小管形成功能，同時顯著增加細胞

7、滲透性。
　　2.通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測了ADAR1siRNA對內皮細胞功能相關蛋白表達的影響。結果表明Caveolin-1在ADAR1 siRNA干預后表達顯著低于對照siRNA組，而VEGF、Sprouty2、p-eNOS和MMP-9在兩組間均無顯著差異。此外，ADAR1 siRNA顯著抑制Caveolin家族另一亞型Caveolin-2和Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達。
　　3.用胞膜

8、通透的Caveolin-1類似物-Cavtratin預處理HUVECs顯著緩解ADAR1siRNA對HUVECs小管形成和細胞滲透性的損傷作用，并上調Caveolin-1下游蛋白VE-cadherin的表達。
　　4.利用Flox/Cre系統(tǒng)成功培育出內皮細胞特異性ADAR1基因敲除小鼠。觀察該小鼠表型發(fā)現(xiàn)內皮特異性ADAR1敲除會導致小鼠出生后4周內死亡75％。病理學檢查各臟器發(fā)現(xiàn)，ADAR1內皮特異性敲除小鼠肺臟組織肺泡上皮增

9、生，部分肺泡腔內出血，間質炎細胞浸潤，肺間質增厚。而與野生型小鼠相比，頸動脈、主動脈、心臟、肝臟和腎臟均無明顯改變。
　　5.透射電鏡觀察肺臟內皮細胞發(fā)現(xiàn)ADAR1內皮特異性敲除小鼠肺血管內皮細胞細胞間間隙增寬。Evans Blue血管滲透性檢測發(fā)現(xiàn)內皮特異性敲除ADAR1增加小鼠肺臟血管滲透性。通過免疫印跡法和免疫熒光法檢測肺臟發(fā)現(xiàn)基因敲除小鼠肺臟Caveolin-1/VE-cadherin表達較野生型小鼠顯著下降。
　　

10、6.通過主動脈環(huán)血管形成實驗和下肢缺血模型檢測小鼠血管新生功能。結果表明內皮細胞缺失ADAR1顯著抑制小鼠胸主動脈血管形成;與野生型小鼠相比，內皮特異性ADAR1敲除小鼠下肢缺血后血流恢復顯著抑制，并且模型組下肢肌肉缺血后血管新生明顯受到抑制。
　　結論：
　　1.ADAR1 siRNA可抑制內皮細胞小管形成和增加細胞滲透性。
　　2.ADAR1 siRNA損傷內皮細胞功能與抑制Caveolin-1/VE-cadher

11、in表達有關;Cavtratin可逆轉ADAR1 siRNA對內皮細胞的損傷作用。
　　3.ADAR1內皮細胞特異性敲除小鼠因肺損傷而導致小鼠出生后部分死亡。
　　4.ADAR1內皮細胞特異性敲除可增加小鼠血管滲透性，抑制下肢缺血后血流恢復和主動脈環(huán)血管形成功能。
　　5.ADAR1內皮細胞特異性敲除可抑制肺臟血管Caveolin-1/VE-cadherin的表達。
　　我們在這項研究中發(fā)現(xiàn)ADAR1敲除增加血管