腺病毒介導(dǎo)的人骨形成蛋白-7基因轉(zhuǎn)染對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖與分化的研究.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建人骨形成蛋白-7(humanmorphogeneticprotein,hBMP-7)腺病毒載體并制備重組病毒液，檢測經(jīng)腺病毒介導(dǎo)hBMP-7基因轉(zhuǎn)染的人牙髓細(xì)胞(dentalpulpcells,DPCs)中外源hBMP-7蛋白的表達(dá)，探討hBMP-7基因轉(zhuǎn)染對(duì)DPCs增殖及向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步開展牙髓暴露基因治療的體外及臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法：分別雙酶切pSPORT6-hBMP-7質(zhì)

2、粒和PSU-CMV質(zhì)粒，回收并純化hBMP-7cDNA片斷和PSU-CMV質(zhì)粒的大片斷，使二者連接獲得含有hBMP-7基因的重組穿梭質(zhì)粒載體，酶切鑒定及測序以證實(shí)構(gòu)建是否成功。采用位置特異性重組方法構(gòu)建hBMP-7基因重組腺病毒載體。用脂質(zhì)體介導(dǎo)PSUCMV-hBMP-7和Pbhge3共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞產(chǎn)生hBMP-7基因重組腺病毒，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增，純化制取高滴度重組腺病毒。以相同的方法擴(kuò)增和純化Ad-EGFP。檢測Ad-EGFP對(duì)牙髓

3、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，以確定Ad-hBMP-7的MOI，用攜帶外源性目的基因的腺病毒感染人牙髓細(xì)胞，Westernblot鑒定重組腺病毒目的基因的表達(dá)情況。四唑鹽比色法(MTT)、酶動(dòng)力學(xué)法、VonKossa染色及半定量RT-PCR分別檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣化結(jié)節(jié)和牙本質(zhì)涎磷蛋白mRNA(DSPPmRNA)的表達(dá)情況。 研究結(jié)果：用位置特異性重組方法成功構(gòu)建了攜帶hBMP-7基因的重組腺病毒載體(Ad-hB

4、MP-7)，其滴度約為1.785×109pfu/ml，確定Ad-hBMP-7對(duì)人牙髓細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)為75；Westernblot檢測出人骨形成蛋白-7的表達(dá)；經(jīng)Ad-hBMP-7轉(zhuǎn)染的人牙髓細(xì)胞增殖能力無明顯改變，同時(shí)其合成ALP的能力能夠得到顯著提高，礦化結(jié)節(jié)形成，DSPPmRNA的表達(dá)呈劑量和時(shí)間依賴性。 研究結(jié)論：Ad-hBMP-7轉(zhuǎn)染人牙髓細(xì)胞后可高效穩(wěn)定表達(dá)。Ad-hBMP-7顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)