Leptin對人牙髓細胞增殖及分化的影響.pdf

1、本文研究目的：體外分離培養(yǎng)人牙髓細胞(humandentalpulpcells，HDPCs)并進行表型鑒定及誘導(dǎo)分化，加入人工重組Leptin(recombinanthumanLeptin，rhLeptin)，檢測Leptin對HDPCs增殖、分化作用的影響。 研究方法：①收集因治療需要拔除的年輕健康恒牙，無菌條件下取出牙髓組織，分別采用組織塊法和酶消化法原代培養(yǎng)HDPCs，待細胞鋪滿瓶底80％時傳代。②取第四代HDPCs采用M

2、TT比色法測定細胞生長曲線，免疫組織化學(xué)方法行波形絲蛋白(Vimentin)和角蛋白(cytokeratin)的免疫染色，鑒定細胞來源。③取第2代HDPCs采用間接免疫熒光法檢測血管周細胞表面抗原CD146的表達，對牙髓細胞中的未分化細胞進行鑒定。分別以成脂化培養(yǎng)基和礦化培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)HDPCs，鏡下觀察細胞形態(tài)變化，28天后行油紅O染色和VonKossa鈣化染色。④取第4代HDPCs采用SABC法檢測Leptin受體(Leptin-R

3、eceptor,LR)在牙髓細胞中的表達。⑤將培養(yǎng)基中加入不同濃度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)培養(yǎng)HDPCs，3天后用MTT比色法檢測細胞增殖情況。第4代HDPCs以含100ng/mLrhLeptin的培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組不含rhLeptin，3天后將細胞制成細胞懸液，采用流式細胞技術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測細胞各周期時相。⑥用加入不

4、同濃度rhLeptin(5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HDPCs，對照組不含rhLeptin。于培養(yǎng)14天后檢測各組細胞堿性磷酸酶(alkalinephophatase，ALP)活性水平，確定rhLeptin最佳作用濃度(100ng/mL)。⑦用含100ng/mLrhLeptin的培養(yǎng)基對HDPCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，28天后觀察鈣化結(jié)節(jié)形成情況，并行VonKos

5、sa鈣化染色。采用SABC法檢測HDPCs礦化相關(guān)蛋白——牙本質(zhì)涎蛋白(dentinsialoprotein，DSP)及骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)的表達情況。 研究結(jié)果：①采用組織塊法培養(yǎng)HDPCs，牙髓組織塊接種6～10天后，可見細胞從組織塊周邊呈輻射狀游出，細胞呈長梭形，少量細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞胞體較大，核仁清晰；采用酶消化法培養(yǎng)HDPCs，消化后的細胞于第2天開始貼壁生長，鏡下見細胞呈梭形，胞體較小，部分細

6、胞形態(tài)不規(guī)則呈多角形或橢圓形，個別細胞生長迅速，呈集落樣生長，形成細胞克隆，克隆中心細胞密集，細胞間界限不清。②MTT法測得細胞生長曲線顯示：1～3天HDPCs生長相對緩慢：從第3天開始進入指數(shù)增殖期，細胞數(shù)量持續(xù)升高；至第7天生長相對緩慢，細胞生長進入飽和期。細胞表型鑒定結(jié)果為波形絲蛋白陽性，角蛋白陰性。③對CD146的免疫熒光檢測結(jié)果顯示：牙髓細胞內(nèi)存在少數(shù)CD146陽性細胞，提示牙髓組織中存在牙髓干細胞(Dentalpulpste

7、mcells，DPSCs)，該細胞可表達血管周細胞抗原CD146。細胞在成脂肪化誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后，可見部分細胞體積增大，胞漿內(nèi)有透明脂滴形成，油紅O染色為橙紅色。礦化誘導(dǎo)4周后細胞可形成鈣化結(jié)節(jié)，VonKossa鈣化染色顯示棕黑色鈣化團塊形成。④免疫組化表明在HDPCs細胞表面有Leptin受體表達。⑤加入不同濃度rhLeptin作用后，實驗組細胞的增殖情況相對于對照組沒有顯著變化(P＞0.05)，流式細胞術(shù)結(jié)果提示了實驗組和對照組細胞的

8、細胞周期時相沒有顯著變化，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(x=0.38，P＞0.05)。⑥含不同濃度rhLeptin的實驗組細胞ALP活性水平明顯高于對照組(即DMEM組)，Leptin對HDPCs的ALP活性有促進作用，并呈一定量效關(guān)系(回歸方程(^y)=0.291+0.0036x，回歸系數(shù)檢驗t=6.49，P=0.003)，其最佳作用濃度為100ng/ml。⑦100ng/mL的rhLeptin誘導(dǎo)培養(yǎng)HDPCs4周后，VonKossa鈣化染色陽

9、性。SABC法對牙髓細胞礦化相關(guān)蛋白檢測的結(jié)果顯示：牙本質(zhì)涎蛋白(DSP)及骨鈣蛋白(OCN)表達陽性。 研究結(jié)論：①采用組織塊法及酶消化法均可在體外成功培養(yǎng)出HDPCs。②體外培養(yǎng)的牙髓細胞內(nèi)含有一定數(shù)量的牙髓干細胞，該細胞具有未分化的間充質(zhì)干細胞的特性，表達血管周細胞表面抗原CD146，并在一定條件下可以向脂肪細胞及成牙本質(zhì)細胞分化。③HDPCs表面有Leptin受體表達，Leptin對HDPCs的增殖無顯著的促進作用，但可