腺病毒介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染兔骺板軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)腺病毒介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染兔骺板軟骨細(xì)胞(Epiphyseal Chondrocytes， ECs)，觀察TGF-β1的表達(dá)及ECs合成和分泌軟骨基質(zhì)的情況，為構(gòu)建新型的組織工程骺板軟骨提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：⑴利用3周齡新西蘭大白兔股骨遠(yuǎn)端骺板軟骨，分離出ECs并傳代培養(yǎng)，觀察ECs生長(zhǎng)情況并鑒定。選用第3代ECs進(jìn)入下一步基因轉(zhuǎn)染。⑵構(gòu)建攜帶TGF-β1基因的腺病毒載體。⑶分3組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：分別為T(mén)GF-β1載體

2、組、空載體組和空白組。轉(zhuǎn)染后在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)以及增殖情況；并在熒光顯微鏡下觀察各組病毒轉(zhuǎn)染情況，同時(shí)計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。利用MTT法檢測(cè)重組腺病毒轉(zhuǎn)染后的ECs增殖能力是否有明顯變化。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后收集到的各組培養(yǎng)液中的TGF-β1濃度。應(yīng)用Ⅱ型膠原免疫熒光評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的成軟骨能力。采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)情況，并用Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞Ⅱ型膠原和TGF-β1蛋白表達(dá)情

3、況。
　　結(jié)果：①成功的從兔骺板軟骨中分離出ECs，并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)及鑒定。②在熒光顯微鏡下觀察各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β1載體組和空載體組有較多熒光細(xì)胞出現(xiàn)，而空白組始終沒(méi)有出現(xiàn)熒光細(xì)胞，細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。通過(guò)MTT法檢測(cè)證明，腺病毒介導(dǎo)TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后的ECs的增殖能力短期內(nèi)沒(méi)有影響。③轉(zhuǎn)染14d后， TGF-β1載體組免疫熒光觀察到Ⅱ型膠原較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。④RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組標(biāo)本中TGF-β1 mRNA的表達(dá)

4、較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。4、Western-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中CollagenⅡ和TGF-β1表達(dá)也明顯增強(qiáng)。
　　結(jié)論：⑴成功的從兔骺板軟骨中分離出ECs，并進(jìn)行了傳代培養(yǎng)及鑒定，證實(shí)了第3代ECs表型穩(wěn)定，骺板軟骨細(xì)胞的生物學(xué)及功能學(xué)特性表達(dá)良好。⑵成功的構(gòu)建了攜帶TGF-β1基因的重組腺病毒載體，并運(yùn)用重組腺病毒載體成功轉(zhuǎn)染ECs，且轉(zhuǎn)染率高，對(duì)細(xì)胞毒性小。⑶利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將TGF-β1基因轉(zhuǎn)染至ECs，可增強(qiáng)ECs合成和