慢病毒介導(dǎo)的Notch配體Deltal RNA干擾對人牙髓干細(xì)胞增殖與分化影響的實驗研究.pdf

1、Notch信號通路是細(xì)胞間一種保守的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡能力的信號機(jī)制。已有研究證實,造血干細(xì)胞的Notch信號通路通過細(xì)胞表面受體與其配體Jagged或Delta相結(jié)合而激活,從而對其在我更新和分化方面起著至關(guān)重要的作用。近年來的研究表明,Notch信號通路在牙齒的修復(fù)過程中起著關(guān)鍵性的作用,牙齒受損誘發(fā)其受體、配體表達(dá),參與Notch信號通路與牙髓干細(xì)胞向血管周細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化過程。根據(jù)已有的研究,認(rèn)為在造血干細(xì)胞中

2、,Notch信號通路的激活會促使造血干細(xì)胞自我更新加快并抑制其分化。然而,在牙髓細(xì)胞中Notch信號通路的功能機(jī)制如何仍需進(jìn)一步研究證實。
　　 牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)的概念由Gronthos在2000年提出,其來源于牙髓組織,被認(rèn)為是成人牙髓組織的前體,在正?；虿±頎顟B(tài)下具有分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞的潛能。已有研究證實,在體外培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞中具有Notch信號通路的表達(dá)。因此,本實

3、驗利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)人牙髓干細(xì)胞中的Notch配體Deltal的表達(dá),研究分析了其對細(xì)胞增殖和分化的影響。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定:牙髓干細(xì)胞來源于臨床上因正畸或阻生而拔除的健康牙齒,采用酶消化法分離獲得并常規(guī)原代并傳代培養(yǎng);鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其克隆形成能力;利用免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型,如Vimentin、GFAP、Nestin和collagentypeⅢ,以及間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)

4、志STRO-1;將細(xì)胞在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)條件下培養(yǎng),觀察其分化潛能。
　　 2.慢病毒感染:牙髓干細(xì)胞被攜帶Deltal特異性RNAi的慢病毒感染,通過Western blot、RT-PCR檢測DPSCs中Deltal基因及Notch通路靶基因Hesl的表達(dá)。實驗將細(xì)胞分成三組,包括由攜帶Deltal特異性RNAi慢病毒感染的DPSCs/Deltal-RNAi組,由空慢病毒感染的DPSCs/vector組和正常細(xì)胞對照DPSCs/w

5、t組。
　　 3.細(xì)胞增殖與分化的檢測:DPSCs中Deltal被干擾下調(diào)后,通過細(xì)胞周期、CCK-8和細(xì)胞核增殖抗原(PCNA)的Western blot檢測細(xì)胞增殖能力;將細(xì)胞成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,利用堿性磷酸酶活性、茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色和DSPP的Western blot檢測細(xì)胞分化改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.連續(xù)培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞增殖快,單個細(xì)胞保持有2-4突起的梭形或星形;細(xì)胞具有克隆形成能力,CFU-

6、F計數(shù)為2～15clones/103 cell;免疫組化及流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示有Vimentin、GFAP、nestin和STRO-1的表達(dá)。經(jīng)成牙本質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后,細(xì)胞出現(xiàn)了牙本質(zhì)涎磷蛋白DSPP的表達(dá),并有鈣化結(jié)節(jié)形成。
　　 2.DPSCs/Deltal-RNAi組的Deltal表達(dá)低于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組,而DPSCs/vector組和DPSCs/wt組的Deltal表達(dá)沒有明顯區(qū)別。
　　

7、 3.DPSCs/Deltal-RNAi組的細(xì)胞增長率和S期及PCNA表達(dá)明顯低于DPSCs/vector組和DPSCs/wt組。與DPSCs/vector組和DPSCs/wt組相比,DPSCs/Deltal-RNAi組細(xì)胞可形成較多鈣化結(jié)節(jié),堿性磷酸酶、DSPP檢測明顯增高。另外,DPSCs/Deltal-RNAi組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變。
　　 結(jié)論:
　　 1.從人牙髓組織中分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞在體外具有一定的克隆形成能

8、力,其表面分子的表達(dá)情況與文獻(xiàn)報道相似,誘導(dǎo)條件下具有分化潛能,符合成體干細(xì)胞特性。
　　 2.人牙髓干細(xì)胞被攜帶Deltal特異性RNAi慢病毒感染后,其Deltal和Notch通路可呈穩(wěn)定低表達(dá)。
　　 3.DPSCs/Deltal-RNAi組牙髓干細(xì)胞較DPSCs/wt組和DPSCs/vector組在相同誘導(dǎo)條件下,更易向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化。
　　 4.Notch信號通路對細(xì)胞的自我更新和分化起著重要作用,N