腺病毒載體介導的人Nanog基因修飾人臍帶間質干細胞的研究.pdf

1、目的：構建人Nanog基因重組腺病毒載體(Ad—Nanog),轉染人臍帶間質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs),檢測nanog基因在hucMSCs中的表達,研究Nanog基因修飾對hucMSCs的生物學特性影響,希望能促進hucMSCs維持自我更新能力及多向分化潛能,為基因修飾hucMSCs的后繼研究提供實驗基礎。
　　 方法：設計含有KpnⅠ及Xho

2、Ⅰ酶切位點的引物,PCR擴增Nanog,將擴增產(chǎn)物亞克隆到pAdTrack-CMV穿梭質粒上,經(jīng)雙酶切和基因測序鑒定,重組穿梭質粒經(jīng)PineⅠ線性化后,在含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重組,篩選獲得Ad-Nanog重組腺病毒質粒,經(jīng)PacⅠ酶切線性化,脂質體轉染293A細胞,包裝和擴增病毒,并感染hucMSCs。通過免疫組織化學,Western blot檢測Nanog在hucMSCs中的表達及亞細胞定位；MTT

3、、平板克隆實驗檢測Nanog修飾對hucMSCs增殖和克隆形成能力的作用；提取細胞的總RNA,并逆轉錄成cDNA,檢測干細胞相關基因的表達情況；裸鼠致瘤實驗評價Nanog修飾hucMSCs的生物安全性。
　　 結果：重組腺病毒質粒經(jīng)PCR和Xho1及Kpn1酶切鑒定正確,測序結果和設計片段的序列一致。熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在感染的hucMSCs中高效表達。Nanog基因修飾促進hucMSCs的增殖,克隆形成,成骨分化。