環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體轉(zhuǎn)化細(xì)胞抑制性消減文庫(kù)的構(gòu)建及差異基因的鑒定.pdf

1、環(huán)形泰勒蟲(chóng)病(Tropical theileriasis)是由環(huán)形泰勒蟲(chóng)（Theileria annulata）寄生于牛淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的一種蜱傳性血液原蟲(chóng)病。環(huán)形泰勒蟲(chóng)及同屬的小泰勒蟲(chóng)（T.parva）是截至目前已發(fā)現(xiàn)的唯一一類可使哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化（永生化）的真核生物，而且這類細(xì)胞轉(zhuǎn)化是可逆的，當(dāng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲(chóng)被抗泰勒蟲(chóng)藥物布帕伐醌（Buparvaquone，BW720c）清除后，轉(zhuǎn)化細(xì)胞將恢復(fù)正常細(xì)胞的有限

2、繁殖特性，進(jìn)入凋亡程序。本研究利用抑制性消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體感染細(xì)胞與正常牛外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）抑制性消減文庫(kù)，并對(duì)部分差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析，最終篩選環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體基因及轉(zhuǎn)化細(xì)胞與宿主正常細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因，為深刻理解環(huán)形泰勒蟲(chóng)與宿主細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)、揭示環(huán)形泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.成功構(gòu)建了環(huán)形泰勒蟲(chóng)

3、裂殖體轉(zhuǎn)化細(xì)胞抑制性消減文庫(kù)，通過(guò)文庫(kù)序列測(cè)序，共獲得364條有效ESTs序列，片段大小主要分布在350～1200bp之間；將所獲ESTs進(jìn)行BLASTn序列比對(duì)，最終獲得192條基因序列，其中來(lái)自環(huán)形泰勒蟲(chóng)的序列60條（包括11條蟲(chóng)體蛋白酶基因序列、10條膜蛋白基因序列、7條假設(shè)蛋白基因序列、5條凋亡相關(guān)蟲(chóng)體蛋白基因序列、5條核糖體蛋白基因序列、4條細(xì)胞周期蛋白基因序列、4條蟲(chóng)體抗原基因序列和14條蟲(chóng)體其它基因序列）、?；蛐蛄?31

4、條（其中19條為腫瘤相關(guān)蛋白基因序列）和1條未知序列。
　　2.通過(guò)對(duì)文庫(kù)中環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體基因進(jìn)行克隆測(cè)序，最終獲得13條全長(zhǎng)CDS序列；利用Protfun、Signa lP3.0、TMHMM2.0和Lasergene（protean）生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)分析：Ta65、Ta129和Ta513蛋白存在較多的抗原表位，可用于后續(xù)診斷抗原或疫苗研制；Ta129、Ta511和Ta513可能具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

5、
　　3.使用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)18S rRNA、GAPDH、ACTB、PRKG1和TBP5個(gè)牛內(nèi)參基因的Real-time PCR引物，以環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非感染牛PBMCs為試驗(yàn)材料，對(duì)引物特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增效率分析，并利用geNorm和NormFinder進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5個(gè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率介于81.2~120.1％，且特異性均較好；18S rRNA和GAPDH具有良好的線性擴(kuò)增

6、；geNorm和NormFinder分析均發(fā)現(xiàn)18S rRNA為最穩(wěn)定內(nèi)參基因；綜合以上結(jié)果，最終確定18S rRNA作為最穩(wěn)定內(nèi)參基因，可用于環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體轉(zhuǎn)化細(xì)胞中信號(hào)通路的研究。
　　4.對(duì)環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體轉(zhuǎn)化細(xì)胞差異基因進(jìn)行Real-time PCR分析；結(jié)果顯示：宿主細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因TFG、HCLS1和SENP5在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平分別是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的2.74、2.06和1.32倍；環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體蛋白基因 Ta65（

7、TA08105）和 Ta129（TA20380）在環(huán)形泰勒蟲(chóng)裂殖體階段的轉(zhuǎn)錄水平分別是裂殖子（紅細(xì)胞內(nèi)寄生階段）階段的2.10和2.08倍。
　　5.利用BW720c作用環(huán)形泰勒蟲(chóng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，殺死蟲(chóng)體，再利用Real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)宿主腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果顯示：相比對(duì)照組，在BW720c藥物處理組中，宿主腫瘤相關(guān)基因HCLS1和TFG的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降；宿主腫瘤相關(guān)蛋白TFG在藥物作