白粉病菌誘導(dǎo)的小麥抑制消減文庫(kù)構(gòu)建及部分差異基因克隆.pdf

1、小麥白粉病是由專性寄生菌禾布氏白粉菌(Erysiphe graminis DC.f.sp.tritici Marchal)引起的真菌性病害，在全世界范圍均有發(fā)生，在濕度大的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重。小麥從一葉期到衰老均會(huì)受到白粉菌的威脅，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量。改變耕作方式、使用農(nóng)藥等化學(xué)手段在一定程度上可以降低白粉病的發(fā)生，但易受到氣候等條件的影響、也會(huì)增加人力、財(cái)力和物力，更重要的是會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，影響人類的健康。推廣抗性品種成為目前最為經(jīng)

2、濟(jì)和有效的措施。由于白粉菌生理小種的變異速度快，單一抗性品種的抗病性易喪失，因此發(fā)現(xiàn)與利用新的抗病基因、培育具有多個(gè)抗病基因聚合的持久抗病品種具有重要意義。本研究通過(guò)抑制性消減雜交技術(shù)，獲得白粉病誘導(dǎo)的小麥差異表達(dá)序列，并對(duì)部分差異基因進(jìn)行了克隆和分析。主要結(jié)果如下：
　　 1、消減文庫(kù)的構(gòu)建
　　 本研究利用本實(shí)驗(yàn)室培育的異附加系小麥SN6306為材料構(gòu)建白粉病菌誘導(dǎo)的消減文庫(kù)，篩選鑒定出一些與光合作用、蛋白質(zhì)合成、細(xì)

3、胞結(jié)構(gòu)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、糖代謝、抗病與防御等相關(guān)的序列，其中有18條與抗病及防御反應(yīng)相關(guān)的EST序列。
　　 2、小麥TaPrxQ基因的克隆及序列分析
　　 通過(guò)消減文庫(kù)得到的序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法在SN6306的cDNA中克隆到了一個(gè)新的TaPrxQ基因cDNA序列，通過(guò)相似性比對(duì)分析顯示TaPrxQ同已報(bào)道的HvPrx的氨基酸序列具相似性達(dá)到88％，結(jié)合進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，推斷TaPrxQ屬于PrxQ類。TaPrx

4、Q基因不含有內(nèi)含子，全長(zhǎng)943bp，cDNA序列包含927bp的開(kāi)放閱讀框，編碼308個(gè)氨基酸殘基，其等電點(diǎn)為9.41，分子量32.4kDa。TaPrxQ基因的克隆與分析為基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 3、小麥TaRUB1基因的克隆、序列分析及功能分析
　　 通過(guò)消減文庫(kù)得到的序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法在SN6306的cDNA中克隆到了一個(gè)泛素相關(guān)蛋白的cDNA序列命名為T(mén)aRUB1。TaRUB1 cDNA序列全長(zhǎng)

5、500bp，其開(kāi)放閱讀框編碼153個(gè)氨基酸殘基，聚類分析揭示其在所有小麥同源序列中的獨(dú)特位置，可能預(yù)示著其具有特殊的功能。TaRUB1基因前半部分編碼泛素蛋白，后半部分編碼NEDD8。用定量PCR技術(shù)分析TaRUB1在白粉菌誘導(dǎo)SN6306后的0h，24h，48h及72h的表達(dá)變化。結(jié)果顯示TaRUB1在SN6306中受到白粉菌誘導(dǎo)后立即出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并在48h時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰。構(gòu)建TaRUB1的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，發(fā)現(xiàn)在干旱和鹽脅迫

6、的條件下轉(zhuǎn)TaRUB1擬南芥植株生長(zhǎng)比野生型植株萌發(fā)率顯著提高，生長(zhǎng)旺盛，對(duì)干旱和鹽脅迫具有一定的抗性，過(guò)量表達(dá)TaRUB1基因使擬南芥抵御逆境的能力得到提高，并且轉(zhuǎn)TaRUB1擬南芥植株的花期提前。對(duì)TaRUB1擬南芥植株與野生型植株接種活體營(yíng)養(yǎng)性病菌PstDC3000及腐生型病原菌Alternaria brassicicola，觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)TaRUB1擬南芥植株的感病情況比野生型的感病情況輕，說(shuō)明轉(zhuǎn)TaRUB1基因提高了擬南芥對(duì)活體營(yíng)