紅麻花藥和花瓣抑制消減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及EST序列的分析.pdf

1、紅麻(Kenaf)是錦葵科（Malvaceae）木槿屬（Hibiscus）一年生韌皮纖維作物，學(xué)名為Hibiscus cannabinusL.，別名為洋麻、槿麻，是重要的麻紡和造紙?jiān)?。本研究以周瑞?yáng)教授選育的紅麻P3B的花藥和花瓣為材料，進(jìn)行花藥抑制消減雜交文庫(kù)構(gòu)建，得到以下結(jié)果:
　　 (1)成功從紅麻花藥和花瓣中提取了高質(zhì)量的總RNA。
　　 (2)從總RNA中抽提純化到高質(zhì)量無(wú)降解的mRNA，并以2μg mRNA

2、為起始材料成功構(gòu)建了差減文庫(kù)，通過雜交效率檢測(cè)證明差減效果較好。將第二次PCR產(chǎn)物收集純化后，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，隨機(jī)挑取正向文庫(kù)和反向文庫(kù)各1440個(gè)克隆至96孔細(xì)菌培養(yǎng)板培養(yǎng)，菌液PCR檢測(cè)，挑選條帶單一，大小在200～750bp的克隆測(cè)序。初步挑選正向克隆500個(gè)測(cè)序，除去非單克隆和高級(jí)結(jié)構(gòu)，得到有效序列442條。
　　 (3)將測(cè)得的442條序列去除載體、接頭以及小于100bp的短片段后，進(jìn)行聚類分析，共得到150個(gè)Clu

3、ster，將有重疊片段(overlapping)的EST序列進(jìn)行比對(duì)拼接得到150個(gè)Unigene。將150條Unigene序列同nt非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到已知同源基因77條，占51.33％;未比對(duì)上的序列有49條序列，占32.67％，可能為新基因;預(yù)測(cè)的同源基因有24條，占16％;同nr非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，有功能注釋的序列有78條，占52％;未知功能序列有15條，占10％;預(yù)測(cè)功能的序列有57條，占38％。
　　 (4

4、)根據(jù)比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步將這些序列進(jìn)行GO功能注釋和COG蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)，按細(xì)胞組分分類:細(xì)胞(14個(gè)unigene)，細(xì)胞器(6個(gè)unigene)，蛋白質(zhì)復(fù)合體（4個(gè)unigene）;按分子功能分類統(tǒng)計(jì):結(jié)合功能(35個(gè)unigene)，催化活性(59個(gè)unigene)，營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性（1個(gè)unigene），結(jié)構(gòu)分子活性(2個(gè)unigene)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性（3個(gè)unigene），轉(zhuǎn)運(yùn)活性（12個(gè)unigene）;按生物學(xué)過程統(tǒng)計(jì)為:細(xì)胞

5、內(nèi)過程(29個(gè)unigene)，生理過程（56個(gè)unigene），生物學(xué)過程調(diào)控(3個(gè)unigene)。按COG庫(kù)中分類文件將這些功能蛋白分為11類:與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，分泌及膜泡運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)序列占3.33％，與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、運(yùn)輸和分解過程的相關(guān)序列占10％，與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)序列占6.67％，與翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊，分子伴侶相關(guān)的序列占6.67％，與能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化相關(guān)的序列占16.67％;與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)相關(guān)的序

6、列占3.33％;與碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)的序列占10％;與無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸和代謝相關(guān)的序列占3.33％;預(yù)測(cè)的功能蛋白序列占6.67％;與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝相關(guān)的序列占30％;與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相關(guān)的序列占3.33％。
　　 (5)通過對(duì)比對(duì)的結(jié)果分析，這些EST序列中，絕大部分編碼的基因產(chǎn)物都和代謝有關(guān)，特別是一些水解酶，蛋白激酶，氧化還原酶系統(tǒng)等。同時(shí)，還有一些功能蛋白如電子載體，離子結(jié)合蛋白，水通道蛋白以及Ca2+結(jié)合蛋白等。這些蛋白都

7、是與呼吸，跨膜運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)緊密相關(guān)，說明此時(shí)的花藥新陳代謝旺盛，這與所取花藥所處的發(fā)育時(shí)期是相關(guān)聯(lián)的。
　　 (6)通過對(duì)蛋白質(zhì)的功能注釋和代謝路徑分析，發(fā)現(xiàn)一些EST序列可能與花藥組織特異性表達(dá)相關(guān)。contig6、contig16、contig24和Z7-F5與查爾酮合酶有關(guān)，Z1-G9和Z7-F2與MADS-box轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。
　　 (7)通過對(duì)選定的8個(gè)unigene進(jìn)行半定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6個(gè)unige