促紅細胞生成素通過上調(diào)SDF-1促進缺血損傷心肌的修復.pdf

1、心肌梗死(myocardium infarction，MI)是引起心力衰竭的重要原因。研究者們正在尋求各種有效的方法以改善心肌梗死后的心功能狀況。越來越多的研究證實，多種干細胞能參與損傷心肌的修復并在一定種程度上改善受損后的心功能。但干細胞的活化、歸巢、存活、增殖以及分化等過程依賴一些小分子蛋白的作用，因此現(xiàn)在又提出了運用小分子蛋白治療心肌梗死的策略。研究報道，在缺血性心肌損傷模型中，促紅紅細胞生成 (EPO)具有抗凋亡和促血管生成的效

2、應，并能減小梗死面積，但其具體的作用機制尚不清楚。據(jù)研究報道，基質(zhì)細胞衍生因子 (SDF-1)能調(diào)節(jié)骨髓干細胞（BMSCs）歸巢到受損的心肌組織，通過促進梗死周圍區(qū)域的血管生成和減少缺血性心肌細胞的凋亡而達到心肌保護作用。另有研究提示，在經(jīng)EPO處理的缺血損傷的心肌組織中SDF-1的表達明顯升高，心功能也得到明顯改善。因此，我們推測EPO可能通過上調(diào)SDF-1的表達而促進了損傷心肌的修復。
　　 EPO在與其受體EPOR結(jié)合后可

3、以激活PI3K/Akt，ERK1/2/MAPK和JAK2/STAT3等信號通路而參與一系列生理或病理反應。在缺血損傷的心肌中EPO通過什么信號機制來調(diào)控SDF-1表達的尚無報道，而STAT3是早已被認可的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)多種基因的表達。基于以上研究基礎，我們設想：EPO對受損心功能具有保護作用，其機制可能是通過激活JAK2/STAT3信號而促進SDF-1的表達，繼而上調(diào)的SDF-1通過其促進BMSCs的歸巢，新生血管的形成以及抑制細

4、胞凋亡等作用，最終使得心肌梗死面積減小而改善心功能。
　　 第一部分、SDF-1在EPO保護缺血損傷心肌過程中的作用
　　 目的：本研究旨在探討SDF-1在EPO保護受損心肌過程中的作用。
　　 方法：建立C57BL/6小鼠心肌梗死模型。在左前降支冠狀動脈結(jié)扎后立即給予心肌組織內(nèi)EPO（3000U/kg）或等量的生理鹽水注射；術后第1天，從尾靜脈注射SDF-1的中和抗體（25μg/只）或等量的IgG進行干預，每隔

5、2天注射一次，共持續(xù)兩周。采用ELISA，qRT-PCR,，免疫組化及免疫熒光方法檢測心肌組織中SDF-1的表達；術后的第3天，TUNEL法檢測梗死周圍心肌組織內(nèi)的細胞凋亡情況；在第14天時，流式細胞技術檢測心肌組織中BMSCs的歸巢情況；在第4周時，通過免疫組化和免疫熒光方法檢測血管密度，并測定心肌梗死面積和心功能。
　　 結(jié)果：ELISA檢測結(jié)果顯示，在EPO處理的小鼠心肌組織內(nèi)SDF-1的表達在心梗后第1天即開始出現(xiàn)明顯上

6、調(diào)，到第4天時達到高峰，第7天出現(xiàn)下降趨勢。---，伴隨著SDF-1表達的升高，EPO處理組小鼠的心肌中凋亡細胞數(shù)明顯減少，同時歸巢至受損心肌的各類BMSCs以及心肌內(nèi)的血管密度均出現(xiàn)明顯增加，心功能亦得到改善。給予SDF-1中和抗體進行干預后的小鼠與EPO組小鼠比較，其心肌組織內(nèi)的細胞凋亡率上升，心肌內(nèi)歸巢的干細胞數(shù)量和血管密度明顯減少，改善的心功能也出現(xiàn)惡化。
　　 結(jié)論：SDF-1通過介導EPO的促血管生成和抗凋亡作用，并

7、誘導BMSCs的歸巢，從而在EPO的心肌保護過程中起著重要作用。
　　 第二部分、EPO活化JAK2/STAT3信號而上調(diào)SDF-1表達
　　 目的：心臟主由心肌細胞，成纖維細胞和心臟內(nèi)皮細胞三種細胞組成，本部分旨在明確EPO主要對哪種類型細胞的SDF-1表達產(chǎn)生影響并探討其作用機制。
　　 方法：分離培養(yǎng)成年小鼠的心肌細胞，心臟成纖維細胞和心臟內(nèi)皮細胞，并分別在低氧環(huán)境(1％ O2，5％ CO2和 94％ N2

8、)下給予 EPO(10 IU/mL)處理，采用ELISA法檢測SDF-1的表達并用TUNEL法檢測各種細胞的凋亡情況；同時分別給予1 mMwortmannin，25mM PD98059或1 μM pPYLKTK-mts分別將PI3K/Akt，ERK1/2/MAPK和 JAK2-STAT3三條信號途徑阻斷后，通過觀察SDF-1的變化情況來初步判斷促進其表達的分子機制。
　　 結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示，在缺氧2h后，EPO處理組的心

9、肌細胞中SDF-1表達即開始升高，8h時達到峰值，同時心肌細胞的凋亡率較低氧組也明顯降低，但該效應能被SDF-1的中和抗體所抑制。在心臟成纖維細胞中，低氧刺激也能促進SDF-1表達上調(diào)，但對EPO無明顯反應。而低氧和EPO處理時對內(nèi)皮細胞中SDF-1的表達均無明顯影響，但當內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中加入重組SDF-1蛋白后，可以檢測到VEGF的表達升高。在EPO處理的心肌細胞中分別加入wortmannin，PD98059，pPYLKTK-mts后

10、，僅pPYLKTK-mts組中的SDF-1表達出現(xiàn)明顯下調(diào)，并伴隨有心肌細胞的凋亡率增加。另外western blot 結(jié)果顯示EPO組心肌細胞中p-STAT3的表達也增加。
　　 結(jié)論：EPO通過活化JAK2/STAT3信號而上調(diào)心肌細胞中SDF-1的表達，繼而發(fā)揮其對受損細胞的保護作用。
　　 綜合第一及第二部分的結(jié)果，本研究證明了EPO通過激活JAK2/STAT3信號而上調(diào)SDF-1的表達，進而誘導BMSCs歸巢至