NAD對抗X射線誘導(dǎo)L02細胞損傷的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 放射治療是惡性腫瘤治療的重要手段之一,但放射治療在殺死腫瘤細胞的同時,不可避免地損傷正常組織,也因此限制了腫瘤放射治療的照射劑量強度,導(dǎo)致腫瘤細胞不能被完全殺滅而使病人生存質(zhì)量的下降。
　　 國內(nèi)外學(xué)者研究提示,輻射致細胞損傷的機理主要集中在如下幾個方面:1)改變細胞信號傳遞途徑:細胞經(jīng)受輻射后,細胞內(nèi)或細胞外多種信號分子受其誘導(dǎo),引起信號傳遞途徑的改變,最終導(dǎo)致細胞凋亡。其中,p53具有中心地位作用[

2、3]。2)DNA損傷:輻射引起DNA損傷,包括單鏈斷裂(SSB)、雙鏈斷裂(DSB)、堿基損傷和蛋白質(zhì)交聯(lián)等多種形式[4]。3)細胞周期調(diào)控:主要通過調(diào)控細胞周期GO/G1、S、G2/M調(diào)控點,調(diào)節(jié)細胞輻射敏感性和輻射抗性[5]。細胞DNA損傷后,野生型p53基因誘導(dǎo)細胞進入G1期,直到損傷DNA修復(fù),若損傷不被修復(fù),p53基因就活化誘導(dǎo)細胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄,使細胞發(fā)生凋亡[6]。4)微環(huán)境變化:細胞的生存離不開其微環(huán)境,包括細胞氧供應(yīng)、

3、pH值、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、離子平衡、細胞因子等,其微環(huán)境改變可引起相關(guān)基因表達和細胞對輻射的反應(yīng)。
　　 隨著細胞輻射損傷分子機制的深入研究,輻射損傷防護方面的研究也取得了較大進展。其中,有關(guān)輻射損傷防護劑的研究,近年來有較多報道,主要涉及以下幾類:1)抗氧化劑,如Amifostine[7,8,9]、NAC[10,11,12]、VitC[13,14]等；2)細胞因子,如IL-2、IL-3、IL-6、TGF等[15]；3)微量元

4、素,如硒、鋅等[16,17]；4)中草藥成分,如人參皂甘、迷迭香等[18,19]。但由于目前研究較多的抗氧化劑Amifostine、NAC毒副作用大,細胞因子作用網(wǎng)絡(luò)化特點以及中草藥成分難以提純,還沒有一種較為理想的輻射防護劑應(yīng)用于臨床。尋找一種新的有效的毒副作用小的輻射防護藥物對輻射防護仍具重要意義。
　　 NAD+,化學(xué)名為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸,是細胞能量代謝重要輔酶,參與細胞氧化還原反應(yīng)和呼吸鏈電子傳遞,在線粒體內(nèi)NAD+

5、接受電子傳遞還原成NADH,通過電子傳遞能夠抑制自由基生成,同時生成細胞代謝所需的ATP,因此可能起到保護細胞免遭輻射損傷的作用。
　　 本研究采用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)方法,初步探討NAD+輻射損傷防護作用及其機制,這對于進一步研究正常組織細胞的放射損傷機理和探尋一種新的有效的、毒副作用小的輻射防護藥物具有理論價值和現(xiàn)實意義。
　　 目的：
　　 本研究通過觀察氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)對輻射損傷的人正常肝細胞株

6、L02細胞的影響,初步探討氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)抗輻射損傷作用及其機制。進而為研究醫(yī)源性和非醫(yī)源性輻射損傷防護、尋求新型放射防護劑提供一種新的思路和手段。
　　 方法
　　 1 細胞培養(yǎng)及分組 正常人肝細胞株L02細胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將L02細胞分為3組:處理組和照射組細胞照射后分別加入含和不含NAD(1000 μg/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基

7、；對照組細胞未照射,僅加入RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　 2 X射線照射 采用Varian 6-MV X線直線加速器,照射劑量為5 Gy,劑量率為500cGy/min,照射源距靶中心距離100cm。
　　 3 MTT法檢測不同濃度NAD對細胞增殖的影響 細胞以每孔3 × 105～5×105/ml接種于96孔組織培養(yǎng)板,100 ul/孔,細胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進行X線

8、照射。照射后去上清,加入RPMI 1640(含10％胎牛血清)稀釋的不同濃度的NAD,分別為0、200、400、600、800、1000、1200、1400 ug/ml,100 ul/孔,在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。用MTT比色法檢測各濃度NAD對L02細胞增殖的影響。
　　 4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 L02細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制備成單細胞懸液,以每孔3×105～5×105/ml接種于6孔組織培養(yǎng)板,1ml/孔,

9、待細胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進行X線照射。照射后去上清,處理組和照射組分別加入含和不含NAD(1000 μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h。收集各組細胞,調(diào)節(jié)細胞濃度為1×106～6×106/ml,采用Annexin V/PI染色,檢測細胞凋亡率。
　　 5 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞以每孔3×105～5×105/ml接種于6孔組織培養(yǎng)

10、板,1ml/孔,待細胞貼壁后去上清,加入0.01mol/LPBS(pH 7.4),按照上述條件進行X線照射。照射后去上清,處理組和照射組分別加入含和不含NAD(1000μg/ml)的RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h。收集各組細胞,調(diào)節(jié)細胞濃度為3×106～6×106/ml,離心后PBS洗滌,加入冰冷的70％乙醇固定,用流式細胞儀檢測細胞周期各時相細胞百分比。
　　 6 流式細胞儀檢測p53、bax、

11、bcl-2蛋白表達百分率 分別收集經(jīng)過上述處理的三組細胞,以0.5％多聚甲醛溶液1ml固定30min,破膜劑裂解細胞后分管、洗滌、離心后去上清,各管分別加入鼠抗人p53、bax、bcl-2單克隆抗體,混勻,37℃孵育1h。洗滌離心后分別加入FITC標記的抗鼠二抗,37℃孵育1h,在流式細胞儀上檢測蛋白表達百分率。
　　 7 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性測定 分別收集5×106個經(jīng)過上述處理的三組

12、細胞,按試劑盒說明書進行每步操作,另設(shè)未加細胞而其他操作一樣的孔為空白對照組,通過酶標儀405nm處測定各孔吸光度OD值。
　　 8 透射電鏡觀察L02細胞形態(tài) 用3％瓊脂糖在錐形離子管中制造中間帶錐形孔的模具,加入收集處理的細胞,離心,2.5％戊二醛固定、1％鋨酸固定雙重固定,酒精梯度脫水,環(huán)氧丙烷浸透,脂包埋,超薄切片,電子染色電鏡觀察。
　　 9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。實驗數(shù)

13、據(jù)用(x)±s表示,行單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1 MTT法檢測不同濃度NAD對細胞增殖的影響 L02細胞在接受5.0Gy X線照射后,加入RPMI 1640(含10％胎牛血清)稀釋的不同濃度的NAD,分別為0、200、400、600、800、1000、1200、1400 ug/ml,在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。MTT檢測細胞增殖活性,隨著NAD濃度的增加,細胞增

14、殖活性升高,在NAD濃度為1000～1400 ug/ml時,照射后細胞增殖活性的增加達到平臺期。因此我們把NAD濃度為1000 ug/ml作為以后的實驗條件。
　　 2 各組細胞凋亡率 細胞照射后培養(yǎng)24h檢測各組細胞凋亡率,對照組(1.50±0.67)與處理組(12.85±1.59)均顯著低于照射組(31.72±3.07)(P<0.05)。說明NAD能明顯降低X線照射后的L02細胞的凋亡率,具有抗X線誘導(dǎo)的細胞凋亡作用。

15、>　　 3 NAD對受照細胞周期的調(diào)節(jié)L02細胞在X線照射后24h時間點G0/G1、S、G2/M期細胞數(shù),照射組與對照組相比G1、S期細胞數(shù)明顯增加,G2/M期細胞數(shù)減少,表現(xiàn)為G1期阻滯；處理組與照射組相比,G1期細胞數(shù)減少,S期和G2/M期細胞數(shù)增加,表現(xiàn)為處于細胞分裂期和細胞DNA合成期細胞數(shù)增加。
　　 4 NAD對X射線誘導(dǎo)的細胞凋亡的凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)L02細胞經(jīng)5.0GyX線照射后培養(yǎng)24h,檢測三組細胞的凋亡相

16、關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)。處理組細胞p53、bax表達低于照射組(P<0.05),而照射組高于對照組(P<0.05),表明細胞受照射后p53、bax表達增強,NAD能夠減少細胞受照射后p53、bax表達。三組細胞的bcl-2表達情況則恰恰相反,處理組細胞bcl-2表達高于照射組(P<0.05),而照射組低于對照組(P<0.05),表明細胞受照射后bcl-2表達減少,NAD能夠上調(diào)細胞受照射后bcl-2的表達。
　　 5 NAD對受照射細胞Ca

17、spase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的影響 細胞經(jīng)照射培養(yǎng)24h后,NAD+處理組L02細胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性較照射組降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明NAD能抑制Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性,從而抑制X線照射引起的L02細胞凋亡。
　　 結(jié)論
　　 一、NAD+能夠抑制X射線誘導(dǎo)的L02細胞增殖活性的下降,

18、能夠降低X射線引起的L02細胞凋亡。
　　 二、X射線引起L02細胞停滯于G0/G1期,NAD+使L02細胞進入S期進行DNA復(fù)制。
　　 三、NAD+能夠減少細胞受照射后p53、bax表達,上調(diào)bcl-2的表達。能夠降低細胞受照射后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的表達。
　　 本實驗通過觀察氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)對輻射損傷的人正常肝細胞株L02細胞的影響表明:NAD+能夠?qū)筙