睪丸Leydig系細(xì)胞的富集、增殖及雄激素分泌組織構(gòu)建.pdf

1、研究背景： 因創(chuàng)傷、腫瘤等造成的睪丸缺失臨床上并不少見，由于先天性疾病、環(huán)境污染、工作壓力日益加劇和人口老齡化等原因，雄激素缺乏性疾病的發(fā)病率具有逐年上升的趨勢[1，2]。針對這類疾病，目前尚無滿意的治療措施。隨著組織工程技術(shù)的不斷進(jìn)步，以組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織，有希望為治療上述疾病提供理想的治療手段[3，4，5]。 種子細(xì)胞來源問題是困擾組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)，采用差速

2、貼壁法能夠從不同種屬的雄性睪丸內(nèi)獲得高純度的成體Leydig細(xì)胞(Adult Leydig cells，ALCs)，初步地解決了工程化雄激素分泌組織研究種子細(xì)胞來源缺乏的問題。但是，Leydig系細(xì)胞(LCs Lineage)的各級細(xì)胞成分是否都能夠通過差速貼壁法獲得，目前尚不得而知。對哺乳動物而言，Leydig系細(xì)胞是一群不斷更新、具有較強(qiáng)的增殖能力的細(xì)胞，通過Leydig干細(xì)胞(Stem LeydigCells，SLCs)的增殖、分

3、化維持群體數(shù)目的動態(tài)穩(wěn)定[6，7]。在充分獲得具有增殖能力的Leydig系各級細(xì)胞成分前提下，實(shí)現(xiàn)Leydig細(xì)胞(LCs)大量的體外增殖培養(yǎng)，對于解決組織工程化雄激素分泌組織種子細(xì)胞來源不足的問題具有重大意義。 研究目的： 本研究擬通過對不同鼠齡大鼠經(jīng)差速貼筆法獲得的睪丸LC具體成分分析，探討差速貼壁法獲得的大鼠睪丸LC的具體細(xì)胞構(gòu)成，檢驗(yàn)差速貼壁法能否有效獲地得睪丸Leydig系各級細(xì)胞成分，包括具有增殖能力的SLC

4、s；探索通過優(yōu)化培養(yǎng)體系，實(shí)現(xiàn)具有增殖能力的LCs細(xì)胞亞群增殖的可行性，并驗(yàn)證增殖細(xì)胞的生物學(xué)活性；通過體外構(gòu)建及去勢動物回植實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)增殖LCs作為雄激素分泌組織種子細(xì)胞的可行性，為解決組織工程化雄激素分泌組織研究中種子細(xì)胞來源不足的問題提供有效手段。 研究方法： 一.差速貼壁法分離純化不同鼠齡大鼠LCs：獲取生后7天、3周齡雄性Wister大鼠雙側(cè)睪丸，無菌去除白膜及較大的血管，用膠原酶震蕩消化和400目(Φ33μm

5、)不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心后貼壁培養(yǎng)2小時(shí)，棄上清并漂洗3此，加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。 二.不同鼠齡大鼠LCs成分分析：生后7天、3周齡大鼠睪丸LCs分離后即刻進(jìn)行3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，鑒定和分析細(xì)胞組成。兩組大鼠睪丸LCs分離后以DMEM/F12培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，檢測細(xì)胞增殖情況。培養(yǎng)4天后進(jìn)行3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，再次分析細(xì)胞組成，檢測細(xì)胞睪酮分泌能力變化。 三.優(yōu)化培養(yǎng)體系

6、對不同鼠齡大鼠LCs增殖的促進(jìn)作用：生后7天、3周齡大鼠睪丸LCs分離后以優(yōu)化培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中觀察細(xì)胞形態(tài)改變，MTT法及細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測細(xì)胞增殖能力；于細(xì)胞分離后即刻、體外培養(yǎng)4天侯分別進(jìn)行3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，分析細(xì)胞成分；檢測細(xì)胞睪酮分泌能力變化。 四.增殖LCs構(gòu)建的雄激素分泌組織生物學(xué)活性檢測：按照移植物種類將移植鼠模型分為3組，①單純?nèi)萁M(對照組)、②LC+材料組和③增殖LC+材料組。收

7、集第一代以DMEM/F12培養(yǎng)4天的LC和優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)4天的增殖LC，分別以相同細(xì)胞密度接種于預(yù)制的可降解聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)生物材料支架上，4小時(shí)后移植入各對應(yīng)組別動物的大網(wǎng)膜內(nèi)、附睪組織內(nèi)。觀察構(gòu)建組織的形成、組織學(xué)形態(tài)、血管化程度等情況，心穿刺取血比較兩組移植鼠血清睪酮水平。 研究結(jié)果： 第一部分差速貼壁法獲得的LC細(xì)胞成分分析 采用差速貼壁法能夠獲得生后7天、3周齡大鼠睪丸LC，細(xì)胞經(jīng)

8、3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，結(jié)果顯示培養(yǎng)初期(貼壁2小時(shí))兩組細(xì)胞3β-HSD陽性率分別為5.4±1.2％、59.2±3.2％，在DMEM/F12培養(yǎng)體系內(nèi)培養(yǎng)4天后，兩組細(xì)胞3β-HSD陽性率分別為93.6±1.2％、95.4±3.2％，兩組培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞均對HCG刺激有反應(yīng)，在HCG作用下睪酮分泌增加。7天齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中睪酮分泌能力逐漸增強(qiáng)，在培養(yǎng)第5天達(dá)到高峰；3周齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)第2天睪酮分泌

9、功能達(dá)到高峰，其后逐漸下降。 第二部分優(yōu)化培養(yǎng)體系對差速貼壁法分離的不同鼠齡大鼠LC增殖的促進(jìn)作用 以優(yōu)化培養(yǎng)體系培養(yǎng)的不同鼠齡大鼠差速貼壁法獲得的睪丸LC均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖，培養(yǎng)過程中細(xì)胞3β-HSD陽性率升高，至原代培養(yǎng)第四天，絕大多數(shù)細(xì)胞均為3β-HSD陽性；兩組增殖細(xì)胞均有睪酮分泌，對HCG刺激均有反應(yīng)，在HCG刺激下睪酮分泌能力明顯提高(P＜0.05)。7天齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中睪酮分泌能力逐漸增強(qiáng)，在

10、培養(yǎng)第6天達(dá)到高峰；3周齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)第3天睪酮分泌功能達(dá)到高峰，其后逐漸下降。 第三部分以增殖細(xì)胞構(gòu)建組織工程化雄激素分泌組織研究 增殖細(xì)胞組、單純LC組種子細(xì)胞與支架材料都能良好地復(fù)合，所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織在三個月的觀察期內(nèi)能夠保持一定的體積，形態(tài)維持良好；與單純LC組比較，增殖細(xì)胞組睪酮分泌功能更加持久。 研究結(jié)論： 本研究證實(shí)差速貼壁法能夠有效獲得大鼠睪丸Leydig系細(xì)胞的各