Ox-LDL與TGFβ1對共培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞增殖與分化的影響.pdf

1、第一部分 SD大鼠MSCs、ECs的培養(yǎng) 目的:體外培養(yǎng)SD大鼠的骨髓間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)、主動脈內皮細胞(Endothelial Cells ECs)，為測定共培養(yǎng)細胞的增殖和MSCs的分化作準備。 方法：MSCs的培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠的股骨與脛骨，應用PBS沖洗骨髓腔，將細胞混懸液以(3-5)×10<'6>/瓶的密度接種到75cm<'2>的培養(yǎng)瓶中，采取全骨髓貼

2、壁法培養(yǎng)SD大鼠的原代MSCs。48小時首次換液，將懸浮未貼壁細胞去掉。以后每三日換液一次，10-14天細胞生長達融合狀態(tài)時，應用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA進行消化，以1：2的比例進行傳代。通過換液與傳代純化MSCs。應用流式細胞儀對P3代MSCs的CD34、CD90進行鑒定。ECs的培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠的胸主動脈，清除血管外結締組織，將其剪成厚約1.5mm的血管環(huán)。以15-20個血管環(huán)/瓶的密度接種于25am<'2>

3、的培養(yǎng)瓶中，以20％胎牛血清的DMEM進行培養(yǎng)。靜止培養(yǎng)60小時后首次換液去掉血管環(huán)，6-8天細胞達單層融合時應用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA進行消化，以1：2的比例進行傳代培養(yǎng)。應用ABC法對P3代細胞的Ⅷ因子進行鑒定。 結果:MSCs原代培養(yǎng)48小時換液后，可見少量細胞貼壁生長，呈集落樣分布于培養(yǎng)瓶底部。換液后細胞呈紡錘形、長梭形生長。10-14天時，細胞呈成纖維狀鋪滿瓶底。傳代細胞生長加快，6-8天既可達單層融合

4、狀態(tài)。P3代細胞經流式細胞儀鑒定，CD34表達率為0.21％，CD90表達率為96.7％；ECs原代培養(yǎng)60小時后，細胞呈集落樣散在分布于培養(yǎng)瓶底部，6-8天即可達融合狀態(tài)，此時細胞呈現典型的‘鋪路石樣’形態(tài)。傳代細胞3天即可達單層融合狀態(tài)，P3代細胞經ABC法鑒定其陽性率可達95％以上。 結論:實驗所采用的細胞培養(yǎng)方法可行，細胞純度能夠達到實驗應用的要求。 第二部分共培養(yǎng)體系的建立和細胞增殖與分化的測定 目的:

5、探討MSCs對聯合培養(yǎng)細胞增殖及自身表達平滑肌肌動蛋白(smooth muscle alpha-actinα-actin SM)的影響。 方法:(1)建立MSCs和ECs增殖共培養(yǎng)體系：對P3-P5代的MSCs與ECs進行消化離心，去除上清后加入適量培養(yǎng)基將細胞吹打混勻，應用細胞計數板進行細胞計數。單純MSCs培養(yǎng)組以10000個細胞/孔加入24孔板中，共培養(yǎng)組MSCs與ECs以9000：1000個細胞/孔的比例加入24孔板中，

6、分別在1、2、3、4天對培養(yǎng)的細胞消化計數。每組每時間點計數6孔，實驗重復3次。(2)建立MSCs和ECs分化共培養(yǎng)體系：對P3-P5代的MSCs與ECs進行消化離心，MSCs去掉上清后加入1ml培養(yǎng)基，吹打混勻，然后避光加入5ng的DAPI(4'6-diamidino-2-phenylindole 2hei 4'6'-二乙酰基-2-苯基吲哚)，37℃避光孵育30min。單純MSCs培養(yǎng)組以10000個細胞/孔加入24孔板中，共培養(yǎng)組M

7、SCs與ECs以9000：1000個細且包/孔的比例加入24孔板中，孔底置蓋玻片，避光培養(yǎng)5天，利用抗α-actin SM熒光抗體，采用免疫組化方法檢測兩組中MSCs胞漿內α-actin SM的表達。 結果:(1)共培養(yǎng)組細胞計數較單獨MSCs培養(yǎng)組減少，但兩組沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)(2)單純MSCs培養(yǎng)組α-actin SM的陽性表達率為44.1％，共培養(yǎng)組MSCs表達α-actin SM的陽性率為23.6％，兩組間有

8、統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 結論:(1)MSCs與ECs具有兼容性，能夠進行直接共培養(yǎng)，且共培養(yǎng)對MSCs的增殖無明顯影響。(2)MSCs本身即可表達α-actin SM，與ECs共培養(yǎng)后α-actin SM表達受到抑制，表明與ECs共培養(yǎng)后可抑制MSCs向平滑肌樣細胞分化。 第三部分 Ox-LDL與TGFβ1對共培養(yǎng)的骨髓MSCs增殖和分化的影響 目的:探討氧化型低密度脂蛋白(Oxiddized low de

9、nsity lipoprotein Ox-LDL)轉化生長因子β1(Transforming growth factor-β1 TGFβ1)對與ECs共培養(yǎng)體系中MSCs增殖和向平滑肌樣細胞(Smooth Muscle CeHs SMCs)方向分化的影響。 方法:對P3-P5代的MSCs與ECs進行消化離心，MSCs去掉上清后加人1ml培養(yǎng)基，吹打混勻，然后避光加入 5ng的DAPI，37℃避光孵育30min。將MSCs與ECs

10、以9000：1000個細胞/孔的比例加入內置蓋玻片的24孔板中，試驗分三組：單純共培養(yǎng)組，不加干預因素；Ox-LDL干預組以5ug/mlOx-LDL進行干預；TGFβ1干預組以5ng/ml的TGFβ1進行干預。共培養(yǎng)細胞避光培養(yǎng)5天，利用抗α-actin SM熒光抗體，采用免疫組化方法檢測三組中MSCs胞漿內α-actin SM的表達。利用Leica Qwin軟件，在熒光顯微鏡高倍視野下計數每組中DAPI標記的細胞核數，測定細胞增殖情況

11、。 結果:(1)MSCs的α-actin SM的表達Ox-LDL(5ug/ml)干預組MSCs表達α-actin SM的陽性率約為9.9％，TGFl31(5ng/ml)干預組MSCs表達(α-actin SM的陽性率約為36.7％，在未干預組，MSCs表達α-actin SM的陽性率約為23.60％，干預組與對照組相比均P<0.05，具有統(tǒng)計學意義。(2)未干預組細胞數為67.80±21.45/高倍視野，Ox-LDL(5ug/m

12、l)干預組細胞數為135.6±39.45/高倍視野，與對照組相比，MSCs細胞數明顯增高P<0.05，具有統(tǒng)計學意義；TGFβ1(Sng/ml)干預組MSCs數量為60.00±20.38/高倍視野，與對照組相比，MSCs細胞數雖有所減少，但P>0.05，兩組間的增殖無明顯差異。 結論：Ox-LDL(5ug/ml)具有促進共培養(yǎng)中MSCs增殖，降低MSCs向平滑肌細胞方向分化，而TGFβ1(Sng/ml)具有促進共培養(yǎng)體系中MSC