抗菌肽CMIV基因在大腸桿菌中的表達(dá)與純化.pdf

1、活性多肽藥物是醫(yī)藥研究的重要領(lǐng)域。經(jīng)過(guò)前期設(shè)計(jì)與改造的中國(guó)家蠶CMIV抗菌肽基因具有特異導(dǎo)向性抗菌抗腫瘤的功能。本實(shí)驗(yàn)人工設(shè)計(jì)合成的柔性接頭，采用融合蛋白表達(dá)技術(shù)，與表達(dá)載體上的硫氧還蛋白(Thioredoxin)基因連接，同時(shí)利用用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)在理想的位點(diǎn)引入His-Tag序列，構(gòu)建了融合表達(dá)載體pTrxFus-CMIV，轉(zhuǎn)化受體菌GI724，得到陽(yáng)性克隆菌-6＃。 首先應(yīng)用ANTHEPROT4.5軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行

2、了分析和預(yù)測(cè)。接著條件優(yōu)化后得知，6＃工程菌目的蛋白高效表達(dá)必須在OD值大約0.5左右用終濃度100ug/ml的色氨酸誘導(dǎo)六小時(shí)。超聲破碎后取樣，分別對(duì)上清液與沉淀進(jìn)行SOS-PAGE膠電泳分析，靶蛋白以可溶狀態(tài)存在。Bandscan4.3掃描分析表達(dá)量大約為17％。融合蛋白80℃熱處理10分鐘后不變性，具有良好的熱穩(wěn)定性。利用這一特性可實(shí)現(xiàn)對(duì)融合蛋白的粗提純。對(duì)目的條帶電洗脫、透析回收、腸激酶切割后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，顯示有活性。最后，在自