纖溶酶基因在大腸桿菌和畢赤酶母中的表達(dá).pdf

1、血栓性疾病已成為常見(jiàn)病和多發(fā)病,列致殘和致死病因的第一位,嚴(yán)重影響人類(lèi)生存質(zhì)量和壽命,針對(duì)溶栓藥物的臨床應(yīng)用要求,研發(fā)特異、高效、安全、價(jià)廉的纖溶酶類(lèi)溶栓藥物具有廣闊應(yīng)用前景。運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù),將現(xiàn)有溶栓藥的優(yōu)點(diǎn)集合起來(lái),設(shè)計(jì)出完美的溶栓藥將是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn),同時(shí),開(kāi)發(fā)新型天然來(lái)源溶栓藥和探索新型結(jié)構(gòu)溶栓藥將是今后研究方向。假蕈狀芽孢桿菌纖溶酶BpFE是土壤中分離得到的一種新型纖溶酶,基因全長(zhǎng)1701 bp(GenBa

2、nk FJ463037),其中954bp為成熟肽基因,據(jù)報(bào)道基因全長(zhǎng)編碼成熟肽之前的序列(基因長(zhǎng)為747 bp)可能與調(diào)控有關(guān),為了進(jìn)一步探討之間的關(guān)系,即分析前端序列的作用及是否與活性有關(guān),所以本工作進(jìn)行了成熟肽基因的克隆與表達(dá)研究,并且為了將來(lái)的生產(chǎn)和研究摸索了其在畢赤酵母中的表達(dá)研究。
　　 本研究結(jié)合對(duì)假蕈狀芽孢桿菌纖溶酶BpFE的報(bào)道,分析其基因序列,設(shè)計(jì)合成一對(duì)含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物,擴(kuò)增得到纖溶酶成熟

3、肽基因G,使用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切表達(dá)載體pET-28a和纖溶酶成熟肽基因,通過(guò)連接構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-G,利用熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,插入序列長(zhǎng)954bp,編碼317個(gè)氨基酸,與GenBank中BpFE成熟肽的954 bp序列一致。BpFE所包含的鋅蛋白酶家族結(jié)構(gòu)域(序列為VIGHELTHAV)沒(méi)有發(fā)生改變。將重組質(zhì)粒pET-28a-G轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21,成功獲得pET-28a-G／B

4、L21工程菌。終濃度為1 mmol／L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白表觀分子量約為40 kD,與理論值一致。誘導(dǎo)菌體超聲破壁后用纖維蛋白平板法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶酶活性,并進(jìn)一步鎳柱親和層析獲得純化,純化產(chǎn)物有纖溶酶活性。由此說(shuō)明基因全長(zhǎng)編碼成熟肽之前的序列在原基因組序列中起調(diào)控作用,對(duì)纖溶酶的活性無(wú)直接影響,因此成熟肽部分就表現(xiàn)有纖溶酶活性。為利于外源基因的胞外表達(dá)便于工業(yè)生產(chǎn),將纖溶酶全長(zhǎng)基因BpFE克隆到

5、畢赤酵母中進(jìn)行初步研究。根據(jù)所獲得的基因序列FJ463037和真核表達(dá)載體pPIC9K的多克隆位點(diǎn)重新設(shè)計(jì)含有.EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-G。將重組質(zhì)粒線性化后,電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中構(gòu)建重組菌株pPIC9K-G／GS115,經(jīng)MD、MM平板快慢型初篩和G418加壓篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株,25℃甲醇誘導(dǎo)后,得到表觀分子量為64 kD的有纖溶活性的蛋白。鎳柱親和層析純化后用纖維蛋白平板法檢測(cè)到纖溶酶活