氨基單糖-葡萄糖胺在內(nèi)皮細(xì)胞活化調(diào)節(jié)中的作用.pdf

1、近年來，眾多的臨床及病理學(xué)的研究改變了研究人員對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程的認(rèn)識(shí)。尤其是免疫組織化學(xué)方法的應(yīng)用，明確了作為脂肪斑或粥樣斑塊的主組成分的泡沫細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，而不是一直以來認(rèn)為的平滑肌細(xì)胞；而且各時(shí)期動(dòng)脈硬化斑塊組織中均觀察到活化T細(xì)胞，這使研究者們著眼于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生過程中的炎癥細(xì)胞的作用。雖然動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織中可見脂質(zhì)塊，動(dòng)脈粥樣硬化不再是單純的脂質(zhì)的異常堆積，而是伴有內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及炎癥的免疫紊亂狀態(tài)。內(nèi)皮細(xì)胞的活

2、化可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子(如ICAM-1)和趨化因子(如MCP-1)，內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)的黏附分子可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，這就是炎癥的起始階段，也是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵性的一步。與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的炎性細(xì)胞在單核細(xì)胞趨化因子和氧化低密度脂蛋白(LDL)的趨化因子的作用下浸潤(rùn)至內(nèi)皮下，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成成熟的巨噬細(xì)胞并表達(dá)清道夫(scavenger)受體，吞噬修飾脂蛋白，進(jìn)一步變成泡沫細(xì)胞。促炎癥細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子(TNF-α

3、)白介素-1β(IL-1β)等也常在動(dòng)脈粥樣硬化灶中表達(dá)，而且早期動(dòng)脈粥樣硬化病人以血清TNF-α濃度增加為特點(diǎn)。研究證明這些細(xì)胞因子可改變細(xì)胞形狀及活力，并影響炎癥部位的血管滲透性；還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)表面黏附分子，調(diào)節(jié)血管張力、血栓形成及單核細(xì)胞的浸潤(rùn)等。 Cationic antibacterial protein of 18 kDa，因?yàn)樗男蛄杏蓛蓚€(gè)亮氨酸開始并由37個(gè)氨基酸組成，所以也稱為L(zhǎng)L-37。值得關(guān)注的是，

4、最近發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化灶的巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)LL-37，而且可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和MCP-1，還可誘發(fā)血管平滑肌細(xì)胞的死亡。 葡萄糖胺是可在生理?xiàng)l件下自然生成的氨基單糖，是氨基葡聚糖生物合成的底物，已在歐洲作為變形性關(guān)節(jié)炎的治療藥物應(yīng)用20余年，在美國(guó)和日本則以輔助治療劑廣泛應(yīng)用。一些短期和長(zhǎng)期臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)葡萄糖胺可顯著改善變形性關(guān)節(jié)炎的癥狀并不伴有明顯的副作用。近年來，研究者們開始探索葡萄糖胺對(duì)其他細(xì)胞的作用及其作用

5、機(jī)制，發(fā)現(xiàn)葡萄糖胺可抑制巨噬細(xì)胞的一氧化氮合酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生；并抑制中性粒細(xì)胞的過氧化物的產(chǎn)生、吞噬、顆粒酶釋放及趨化。Chen等人研究證明葡萄糖胺還可抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的ICAM-1的表達(dá)，提出葡萄糖胺緩解眼部炎癥的可能性。這些結(jié)果均提示葡萄糖胺的潛在的抗炎癥作用。基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將葡萄糖胺對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化的作用為研究對(duì)象，觀察了葡萄糖胺對(duì)由TNF-α或LL-37(一種表達(dá)在動(dòng)脈粥樣硬的抗菌肽)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和MCP-

6、1表達(dá)的作用。 方法： 1、細(xì)胞實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞的培養(yǎng)及處理人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)培養(yǎng)在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM-2)中。50-60％融合密度的HUVECs先用不同濃度的葡萄糖胺孵育兩個(gè)小時(shí)，隨后用4μMLL-37或0.5ng/mlTNF-α刺激24小時(shí)(mRNA及蛋白質(zhì)的測(cè)定)或10分鐘(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子磷酸化的分析及測(cè)定)。 (

7、2)實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)ICAM-1、MCP-1、GAPDH的mRNA水平的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)葡萄糖胺對(duì)LL-37或TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的ICAM-1和MCP-1的mRMA的影響。 (3)ELISA法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生的MCP-1蛋白質(zhì)。 (4)Westernblot法分析ICAM-1蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。 (5)Westernblot法分析葡萄糖胺對(duì)HVECs蛋白質(zhì)O-GlcNAc修飾的影響，并用Alloxan，

8、O-GlcNAc修飾抑制劑分析該修飾與ICAM-1、MCP-1蛋白質(zhì)的表達(dá)的相關(guān)性。 (6)Westernblot法研究葡萄糖胺對(duì)LL-37或TNF-α誘導(dǎo)活化的p38MAPK、NF-κB、ERK活化即磷酸化的影響。 2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn) (1)動(dòng)物分組：8周齡B6.KOR.Apoesh1小鼠(高膽固醇血癥，動(dòng)脈粥樣硬化自然發(fā)生小鼠模型，雌性)，并作為對(duì)照組同時(shí)購(gòu)C57BL/6(8周，雌性)。小鼠在24±3℃，相對(duì)濕度5

9、5±15％，7:00AM-7:00PM照明條件下飼養(yǎng)。B6.KOR.Apoesh1小鼠隨機(jī)分為3組即葡萄糖胺非處理組、300mg/kg和1000mg/kg投藥組(10只/組)，對(duì)照組為5只C57BL/6。 (2)動(dòng)物的處理及樣品的制備在乙醚麻醉下，腹腔大動(dòng)脈穿刺取血(使用肝素)，血液樣品離心(12,000rpm，4℃)5min，取上清即血漿在-80℃保存。采血后的小鼠用20％福爾馬林/PBS灌流、固定、并摘取心臟。 (3

10、)心臟的OilRedO染色法分析葡萄糖胺處理對(duì)主動(dòng)脈瓣處的動(dòng)脈粥樣硬化病灶大小的影響。 (4)測(cè)定血漿中的HDL、膽固醇、過氧化脂質(zhì)(lipidperoxide)等動(dòng)脈粥樣硬化評(píng)價(jià)指標(biāo)的含量，觀察葡萄糖胺對(duì)這些物質(zhì)濃度的影響，并分析與動(dòng)脈粥樣硬化病灶面積的相關(guān)性。 結(jié)果： 1、葡萄糖胺在mRNA和蛋白水平抑制了LL-37和TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的ICAM-1和MCP-1表達(dá)。 2、葡萄糖胺誘導(dǎo)了蛋白的O

11、-GlcNAc修飾，這與對(duì)表達(dá)的抑制作用一致。 3、O-GlcNAc修飾的抑制劑alloxan恢復(fù)了葡萄糖胺對(duì)ICAM-1和MCP-1的抑制作用。 4、葡萄糖胺抑制了LL-37和TNF-α誘導(dǎo)活化的p38MAPK、NFκB、ERK磷酸化，O-GlcNAc抑制劑Alloxan可部分恢復(fù)葡萄糖胺的抑制作用。 5、葡萄糖胺處理組與對(duì)照組相比，明顯抑制了動(dòng)脈粥樣硬化病灶的形成(300mg/kg.day葡萄糖胺組，P＜0.

12、05)。雖然觀察不到劑量依存性效果，1000mg/kg.day葡萄糖胺組也有抑制動(dòng)脈粥樣硬化病灶形成的趨勢(shì)。 6、葡萄糖胺雖然沒有影響血漿中的HDL和膽固醇濃度，但是顯著抑制了過氧化(LPO)脂質(zhì)的形成。 結(jié)論： 1、葡萄糖胺抑制LL-37和TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的黏附分子ICAM-1和MCP-1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的活化。 2、葡萄糖胺誘導(dǎo)的蛋白O-GlcNAc修飾與其對(duì)表達(dá)的抑制作用相關(guān)，而且O-Gl