靶向X區(qū)的lhRNA表達(dá)載體抑制HBV基因的復(fù)制和表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建針對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)X基因的長(zhǎng)發(fā)卡RNA(lhRNA)表達(dá)載體,觀察其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV基因表達(dá)和復(fù)制的影響。
　　 方法：設(shè)計(jì)并合成4條針對(duì)HBV X區(qū)基因的siRNA寡核苷酸,轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,分別收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。通過(guò)ELISA定量檢測(cè)HBsAg濃度,熒光定量PCR法檢測(cè)上清液中HBV DNA的含量,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)靶基

2、因mRNA的抑制效果;將篩選出的對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV基因表達(dá)和復(fù)制有抑制作用的2條siRNA分別構(gòu)建兩個(gè)表達(dá)載體,利用疊加PCR方法合成含有H1啟動(dòng)子的插入片段,連接插入pMDTM18-T載體中,構(gòu)建長(zhǎng)發(fā)夾RNA表達(dá)載體。經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序插入成功后,重組載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、72小時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。ELISA法定量檢測(cè)HBsAg、HBeAg濃度,熒光定量PCR法檢測(cè)上清液中HBV DNA的濃

3、度。
　　 結(jié)果：成功篩選出兩條有效抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV基因表達(dá)和復(fù)制的siRNA;并且構(gòu)建了靶向HBV X區(qū)的lhRNA表達(dá)載體pMD-X1和pMD-X2;siRNA-1和siRNA-4可以抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg分泌,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且可以抑制上清液中HBV DNA的復(fù)制,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩重建載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,均能明顯抑制HepG2.2.