HBV核心區(qū)啟動子反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、背景
　　 HBV感染是一個嚴(yán)重威脅到人類健康的全球性問題,HBV是引起急慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的重要致病因素。抗病毒治療是目前慢性乙型肝炎的關(guān)鍵性治療措施,現(xiàn)有的抗病毒藥物干擾素-α和核苷類似物的療效有限,基因治療日益成為目前的研究熱點之一?；蛑委煹年P(guān)鍵在于選擇良好的轉(zhuǎn)基因載體、合適的目的基因和實現(xiàn)目的基因的可控性表達(dá)?；蚬こ讨袘?yīng)用最多的載體是真核細(xì)胞表達(dá)載體,如病毒類載體,它們能將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞并穩(wěn)定表

2、達(dá)。本實驗選擇真核表達(dá)載體pEGFP-C1,為在細(xì)胞水平和體內(nèi)觀察其抑制HBV復(fù)制效果打下基礎(chǔ),同時選擇HBV core啟動子(core promoter,cp)作為目的基因(因為該啟動子指導(dǎo)HBV pgRNA和pc mRNA轉(zhuǎn)錄的正確啟動),構(gòu)建HBV cp的反義真核表達(dá)載體,該載體可以轉(zhuǎn)錄出cp的反義RNA,反義RNA與pgRNA中的cp部分結(jié)合有可能使pg RNA逆轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA受阻,同時可能導(dǎo)致pg RNA翻譯蛋白的水平下降,

3、從而使HBV合成和包裝下降,最終有可能使HBV的復(fù)制長期受到抑制。
　　 目的
　　 HBV核心區(qū)啟動子的克隆及其反義真核表達(dá)載體的構(gòu)建,為乙型肝炎的基因治療探索新的治療靶點。
　　 方法：
　　 1.提取HBV DNA:選取外周血HBV DNA載量大于106IU/ml的慢性乙型肝炎患者,用體液病毒提取試劑盒提取HBV DNA。
　　 2.PCR擴增HBV核心區(qū)啟動子序列:選取HBV全長序列中nt

4、1636-nt1860作為擴增片段(該片段包含有HBV核心區(qū)啟動子),用Taq DNA聚合酶進行PCR反應(yīng)擴增HBV核心區(qū)啟動子,瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴增產(chǎn)物,初步確定引物及提取的HBV DNA模板的可實用性；用Pfu DNA聚合酶PCR擴增HBV核心區(qū)啟動子序列,以增加擴增基因的保真性,擴增產(chǎn)物進行載體構(gòu)建。
　　 3.重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp的構(gòu)建及鑒定:將擴增的HBV核心區(qū)啟動子和真核表達(dá)載體pEGFP-C1經(jīng)限

5、制性內(nèi)切酶SacⅡ和HindⅢ分別酶切,用T4DNALigase連接后得到重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp。將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌(escherichia coli,E.coli)DH5α,選取陽性克隆進行PCR、酶切鑒定,鑒定后測序。
　　 結(jié)果：
　　 1.HBV核心區(qū)啟動子的PCR擴增:用Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在225bp處有特異性條

6、帶出現(xiàn)。
　　 2.重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp的鑒定:重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp PCR反應(yīng)后電泳,結(jié)果顯示在225bp處有特異性條帶出現(xiàn)；重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp經(jīng)SacⅡ和HindⅢ酶切后電泳,結(jié)果顯示在約225bp和4700bp處均有特異性條帶出現(xiàn)；重組質(zhì)粒pEGFP-C1-cp中HBV核心區(qū)啟動子測序結(jié)果與GeneBank公布的序列相一致,同源性為97％。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗成功克隆