人Tollip基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗HBV的體外研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)的感染在中國(guó)高發(fā)，其持續(xù)感染易導(dǎo)致肝硬化和肝癌，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，所以防治HBV感染成為我國(guó)傳染病研究的熱點(diǎn)。乙肝疫苗對(duì)未感染者具有明顯保護(hù)作用，但是，HBV感染尤其是慢性感染的治療仍然面臨很大的困難。目前，核苷類(lèi)藥物和干擾素被廣泛用于抗HBV治療，但缺乏切實(shí)有效的長(zhǎng)期應(yīng)答效應(yīng)以及個(gè)體耐藥等因素制約了療效，亟需尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物。Toll樣受體(Toll like recep

2、tors，TLRs)作為一種重要的病原生物模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別HBV等病毒。TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)和機(jī)體天然免疫中起著舉足輕重的作用，該通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子可能成為抗HBV的新靶點(diǎn)。Toll作用蛋白(Toll-interacting protein，Tollip)是TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭蛋白，它對(duì)HBV的感染有何影響是一個(gè)值得探討的問(wèn)題。
　　本文通過(guò)構(gòu)建含HA標(biāo)簽蛋白的Tollip真

3、核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip，并成功轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15，通過(guò)觀察其對(duì)HBV抗原的影響，分析TLR/IL-1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要分子的表達(dá)，以期初步闡明Tollip在抗HBV感染中的作用，為乙肝的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。具體內(nèi)容如下：
　　目的：構(gòu)建含HA標(biāo)簽的重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-HA-Tollip，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)HBV抗原分泌的影響并探討其機(jī)制。
　　方法：1.構(gòu)

4、建真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip雙酶切及DNA測(cè)序鑒定。2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將質(zhì)粒pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。3.ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg的表達(dá)。4.Western-Blot法檢測(cè)AKT、p-AKT、NF-kB的差異表達(dá)。
　　結(jié)果：1.成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pCMV-HA-Tollip。2.質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hep02.2.15細(xì)胞48h后，3μg空質(zhì)粒與3μg pCMV-HA-

5、Tollip共轉(zhuǎn)染組、6μg pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染組中HepG2.2.15細(xì)胞的HBsAg和HBeAg分泌量明顯低于6μg空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組，對(duì)HBsAg的抑制率分別為24％和41％(p<0.01)，對(duì)HBeAg的抑制率分別為13％和31％(p<0.01)；與6μg空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，3μg空質(zhì)粒與3μg pCMV-HA-Tollip共轉(zhuǎn)染組和6μg pCMV-HA-Tollip轉(zhuǎn)染組中NF-kB、p-AKT的表達(dá)明顯降低(p<