版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、背景和目的:
將病毒載體設(shè)計(jì)成能夠攜帶外源基因并按著親代病毒的侵入路徑到達(dá)細(xì)胞體內(nèi)的病毒變異體是病毒載體研究的新思路。對(duì)一些病毒家族來說,攜帶報(bào)告基因的復(fù)制型載體能夠在簡(jiǎn)化和量化檢測(cè)復(fù)制和感染、識(shí)別抗病毒和病毒易感細(xì)胞等方面成為有力的工具。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV),是引起乙型病毒性肝炎的小包裹DNA病毒,原則上在這個(gè)僅有3.2kb的基因組內(nèi)插入外源基因不可避免地會(huì)影響本身的復(fù)制元件。HBV復(fù)制子通
2、過前基因組RNA(pregenomicRNA,pgRNA)逆轉(zhuǎn)錄而來,pgRNA作為雙順反子mRNA,在形成核心蛋白(C)和逆轉(zhuǎn)錄酶(Pol)方面也是必需的,C和Pol開放讀碼框架(openreadingframes,ORF)有150bp的重疊區(qū)。PolORF的下游區(qū)翻譯一般不涉及內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)。我們?cè)O(shè)想將C、P重疊區(qū)域拉開,插入兩個(gè)IRES分別用于表達(dá)外源基因和
3、P蛋白,產(chǎn)生一個(gè)有功能的且不影響包膜蛋白表達(dá)的三順反子pgRNA。為了減少對(duì)基因組長(zhǎng)度的影響,我們利用僅含22個(gè)nt的RNA結(jié)合基序蛋白3(RNA-binding motif protein3,Rbm3)IRES,構(gòu)建了分別攜帶399bp的殺稻瘟菌素抗性基因(blasticidin resistance,BsdR)和720bp的人綠色熒光蛋白(humanized Renilla green fluorescent protein,hrG
4、FP)的HBV載體,研究發(fā)現(xiàn)仍有復(fù)制能力,能產(chǎn)生同野生型HBV一樣的病毒蛋白,所形成的的病毒顆??捎糜诟腥綡epRG細(xì)胞。這種新型的攜帶外源基因的HBV載體將成為研究HBV的有力工具。
方法:本課題分三部分進(jìn)行探討。
第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達(dá)活性研究
1、構(gòu)建攜帶CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,
5、EGFP)的四種質(zhì)粒:I:pCH-EMCVIRES-EGFP(包含腦炎心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)IRES及EGFP);II:pCH-22ntIRES-EGFP(包含Rbm3IRES及EGFP);III:pCH-BsdR-22ntIRES-EGFP(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及EGFP);IV:pCH-pATG-EGFP(包含HBVC基因N端部分與
6、EGFP)。ELISA檢測(cè)I、II、III載體轉(zhuǎn)染HepG2或Huh7細(xì)胞后72h的上清液中HBeAg的表達(dá),并觀察四種載體轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)。
2、構(gòu)建攜帶HBVC基因啟動(dòng)子和熒光素酶基因(Renillaluciferase,RLuc)的四種質(zhì)粒:I:pHBV-EMCVIRES-RLuc(包含EMCVIRES及RLuc);II:pHBV-22ntIRES-RLuc(包含Rbm3IRES及RLuc);III:pHBV-Bsd
7、R-22ntIRES-RLuc(為三順反子載體,依次包含Rbm3IRES,BsdR,Rbm3IRES及RLuc);IV:pHBV-pATG-RLuc(包含HBVC基因N端部分與RLuc)。四種質(zhì)粒分別同對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Control共轉(zhuǎn)染HepG2或Huh7細(xì)胞,通過雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶值。
第二部分:復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其表達(dá)與復(fù)制能力研究
構(gòu)建兩種復(fù)制型HBV載體:pCH-BsdR和pCH-hr
8、GFP。兩個(gè)質(zhì)粒和攜帶野生型HBV的質(zhì)粒pCH-3093分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察外源基因hrGFP的表達(dá),Bsd篩選細(xì)胞克隆。Northernblot檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后RNA的表達(dá)。Westernblot、Nativewesternblot分別用于檢測(cè)HBV包膜、核心蛋白和組裝的核心顆粒。ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。內(nèi)源性聚合酶反應(yīng)(endogenous polymera
9、se reaction,EPR)檢測(cè)功能性P蛋白表達(dá)。Southernblot檢測(cè)HBV復(fù)制中間體。熒光定量PCR法分析細(xì)胞上清液中HBVDNA含量。CsCl密度梯度離心法分離細(xì)胞上清液中的病毒顆粒。
第三部分:復(fù)制型HBV載體的感染特性研究
野生型HBV質(zhì)粒pCH-3093、pCH-BsdR和pCH-hrGFP分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,通過聚乙二醇8000沉淀上清中的重組病毒顆粒,用于感染HepRG細(xì)胞,感染8天后,
10、經(jīng)Northernblot檢測(cè)HBVRNA的水平,ELISA測(cè)定細(xì)胞上清液中的HBsAg和HBeAg。病毒顆粒與高效價(jià)HBV免疫球蛋白(hepatitis Bimmuno-globulin,HBIG)預(yù)孵育1h后再感染HepRG細(xì)胞以驗(yàn)證重組HBV顆粒是否能被抗體阻斷。
結(jié)果:
第一部分:22-ntRbm3IRES在HBV前基因組RNA上的表達(dá)活性研究
1、I、II、III號(hào)載體轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7后,
11、HBeAg表達(dá)均無顯著差異。從第一組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2后觀察熒光強(qiáng)度分析,攜帶Rbm3IRES雙順反子載體(II)中Rbm3IRES的翻譯起始效率明顯強(qiáng)于EMCVIRES(I);相對(duì)于雙順反子載體(II),在三順反子載體上(III)串聯(lián)的第二個(gè)Rbm3IRES引導(dǎo)的EGFP表達(dá)強(qiáng)度下降較多;但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列引導(dǎo)的EGFP表達(dá)水平(IV)。
2、從第二組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細(xì)胞后有相似的熒光素酶結(jié)
12、果,Rbm3IRES產(chǎn)生的熒光素酶活性(II)為EMCVIRES產(chǎn)生熒光素酶活性(I)的兩倍有余(IIVSI,P<0.01)。三順反子載體上Rbm3IRES產(chǎn)生的熒光素酶活性較雙順反子明顯下降(IIIVS
II,P<0.01),但是仍明顯高于HBV自身翻譯起始序列產(chǎn)生的熒光素酶活性(IIIVSIV,P<0.05)。
第二部分:復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其表達(dá)與復(fù)制能力研究
成功構(gòu)建HBV載體pCH-BsdR和
13、pCH-hrGFP。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能觀察到高水平綠色熒光蛋白表達(dá),經(jīng)Bsd篩選可形成穩(wěn)定的Bsd抗性細(xì)胞克隆。均可產(chǎn)生攜帶外源基因的pgRNA,有同野生型HBV相似的核心和包膜蛋白,載體之間HBsAg和HBeAg的分泌量無明顯差異。BsdR載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能翻譯出有功能的P蛋白。BsdR載體的復(fù)制能力為野生型HBV的40%,hrGFP載體復(fù)制能力明顯減弱。然而,這兩個(gè)載體都能夠形成有包膜的病毒。
第三部分:復(fù)制型HBV載體的感染特性
14、研究
利用pCH-BsdR和pCH-hrGFP能夠制備重組病毒顆粒,能夠感染HepRG細(xì)胞。感染8天后,Northernblot可以檢測(cè)到前基因組和亞基因病毒RNA,ELISA測(cè)定出同野生型HBV一樣的HBsAg和HBeAg的分泌趨勢(shì),HBV-hrGFP病毒感染HepRG后可以檢測(cè)到hrGFP的表達(dá)。通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組HBV通過與野生型HBV相同的方式(通過HBV外膜蛋白)感染HepaRG細(xì)胞。
結(jié)論:
15、 1、不管是用CMV啟動(dòng)子還是HBVC基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng),Rbm3IRES都比EMCVIRES有較高的翻譯起始效率。在HBVC基因和P基因之間插入了外源基因的三順反子載體中,串聯(lián)的兩個(gè)Rbm3IRES均有能力引導(dǎo)翻譯起始過程。
2、把C、P蛋白分開表達(dá),利用2個(gè)僅22-nt的強(qiáng)效IRES分別表達(dá)外源基因和P蛋白,保持了各結(jié)構(gòu)蛋白的完整性又盡量少擴(kuò)充基因組容量,實(shí)現(xiàn)載體功能并保持復(fù)制能力。
3、利用構(gòu)建的HBV載體制備的
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 表達(dá)外源基因的雞源大腸桿菌1型菌毛載體的初步構(gòu)建.pdf
- 人IFN-β基因復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建.pdf
- 可示蹤的復(fù)制型HBV載體的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究.pdf
- 攜帶人白細(xì)胞介素18基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建、鑒定和滴度測(cè)定
- HBV反基因?qū)BV復(fù)制影響的研究.pdf
- 靶向X區(qū)的lhRNA表達(dá)載體抑制HBV基因的復(fù)制和表達(dá).pdf
- 外源性microRNA阻斷HBV和HBV復(fù)制相關(guān)的宿主基因表達(dá)對(duì)HBV復(fù)制水平的影響.pdf
- 含外源Th細(xì)胞表位的HBV S基因重組載體在酵母中的表達(dá)研究.pdf
- WHV-HBV嵌合病毒復(fù)制型克隆構(gòu)建及其持續(xù)復(fù)制小鼠模型的建立.pdf
- 攜帶rIL-10復(fù)制缺陷型重組腺病毒rMSC的構(gòu)建.pdf
- 乙型肝炎病毒(HBV)X基因的真核細(xì)胞載體的構(gòu)建.pdf
- 攜帶vgb基因枯草芽孢桿菌整合載體的構(gòu)建和表達(dá).pdf
- 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆外源基因結(jié)構(gòu)分析及轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建.pdf
- 減毒雞傷寒沙門氏菌△asd缺失株的構(gòu)建及其攜帶外源基因的表達(dá).pdf
- 腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾體外抑制HBV復(fù)制的研究.pdf
- 人Tollip基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗HBV的體外研究.pdf
- 多拷貝策略構(gòu)建瑞氏木霉外源基因系列表達(dá)載體.pdf
- HBV基因分型芯片的構(gòu)建及臨床初步應(yīng)用.pdf
- 新型JEV復(fù)制子載體的構(gòu)建及表達(dá)炭疽PA的JEV復(fù)制型DNA載體的免疫原性研究.pdf
- 雙自殺基因復(fù)制缺陷型慢病毒載體的構(gòu)建及其在異基因骨髓移植中的應(yīng)用研究.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論