應(yīng)用LCM技術(shù)結(jié)合冰凍切片捕獲奶牛生精細(xì)胞及RNA的提取.pdf

1、精原細(xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂后生成圓形精子細(xì)胞，再經(jīng)變態(tài)發(fā)育，最終成為成熟精子，在變態(tài)發(fā)育過程中，染色質(zhì)高度固縮，轉(zhuǎn)錄活性逐漸降低，并伴隨細(xì)胞質(zhì)的大量丟失，導(dǎo)致精子細(xì)胞內(nèi)RN A含量極少。目前，精子內(nèi)種類繁多的RN A成分雖已被檢測證實，但精子是否存在轉(zhuǎn)錄活性仍存在較大爭議，因此，研究精子變態(tài)前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢具有重要意義。本實驗室前期對模式動物小鼠精子發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行了研究，通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在圓形、長形精子細(xì)胞和成熟精子間存在大量差異表

2、達(dá)基因，且通過熒光定量 PCR驗證了結(jié)果的可靠性。對于荷斯坦牛精子發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是否和嚙齒動物有相同的變化趨勢，其與體細(xì)胞的差異性仍需進(jìn)行深入研究。
　　本實驗采集了荷斯坦牛睪丸及附睪組織，在前期小鼠實驗基礎(chǔ)上，通過延長組織塊平衡和切片染色時間及加大激光能量及頻率等條件優(yōu)化，建立了合適的荷斯坦牛睪丸組織冰凍切片制作、染色及激光顯微切割捕獲體系。通過優(yōu)化后的體系共捕獲了90576個圓形精子細(xì)胞、122651個長形精子細(xì)胞及67

3、818個精原干細(xì)胞樣品（每樣品各三個生物學(xué)重復(fù)），并通過精子浮游法獲得107個附睪尾精子，為后續(xù)研究提供了可靠的實驗材料。
　　由于精子難以裂解、RNA含量低，且制備難度大，本研究比較了兩種試劑盒及 Trizol法三種RNA制備方法的制備效果，發(fā)現(xiàn)RNeasy Kit的RNA制備效率高且效果穩(wěn)定（單個精子RNA含量為0.023~0.025 pg），可以用于后續(xù)高通量測序 RNA樣品的制備。并采用 PicoPureTMRNA Iso

4、lation Kit進(jìn)行了圓形、長形精子細(xì)胞及精原干細(xì)胞的RNA制備。在進(jìn)行精子RNA制備時，采用的體細(xì)胞裂解液進(jìn)行了白細(xì)胞、上皮細(xì)胞等體細(xì)胞的去除，并利用白細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特異表達(dá)基因CD45和CDH1及持家基因GAPDH（跨內(nèi)含子設(shè)計引物）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測體細(xì)胞及基因組污染，以確保后續(xù)高通量測序的RN A樣品質(zhì)量。另外，本研究通過大量細(xì)胞樣本，測算了單個生精細(xì)胞RN A含量，單因子方差分析結(jié)果顯示，圓形精

5、子細(xì)胞、長形精子細(xì)胞、附睪尾精子及精原干細(xì)胞 RN A含量有顯著差異，不但二倍體細(xì)胞（精原干細(xì)胞）和生殖細(xì)胞間存在顯著差異，隨著精子細(xì)胞的變態(tài)發(fā)育，其RN A含量逐漸減少，精子細(xì)胞圓形和長形精子細(xì)胞中RN A含量分別為附睪尾精子的752和413倍。采用Smart-seq2方法對各級生精細(xì)胞cDNA進(jìn)行微量擴(kuò)增，并檢測其cDNA量及完整性，各樣品cDNA含量均高于20 ug，且在1~2 kb間均有目的產(chǎn)物，完整性較好，符合建庫要求。本研究