n-乙基-1’-氧代靛玉紅的抗腫瘤活性及其可能機制.pdf

1、目的:檢測新合成的一種靛玉紅衍生物，N-乙基-1'-氧代靛玉紅(N-Ethyl-1'-oxindirubin，E-1'-OI)在體抑瘤效果、離體腫瘤細(xì)胞毒性及其可能的作用機制。
　　方法:用MTT實驗測定E-1'-OI對不同腫瘤細(xì)胞(HeLa、HCT116和HepG2)的毒性，并計算半數(shù)抑制率(IC50)。用HepS移植瘤模型測定E-1'-OI的在體抗腫瘤活性。對腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色，用western blot檢測了腫瘤組織

2、中PARP、caspase-3、PCNA(proliferating cell nuclear antigen)和p-STAT3(phospho-transcription factor signal transducer and activator of transcription3)蛋白的表達(dá)，免疫組化分析腫瘤組織中PCNA和p-STAT3的表達(dá)，以研究E-1'-OI抑制HepS移植瘤生長的機制。對荷瘤小鼠的體重及其免疫器官指數(shù)進(jìn)行

3、測定，分析E-1'-OI的毒性作用。用HepG2細(xì)胞進(jìn)行E-1'-OI的機制研究。用PI染色法測定細(xì)胞周期，AnnexinⅤ/PI雙染色法測定細(xì)胞凋亡，JC-1染色法測定細(xì)胞線粒體膜電位，Western blot測定線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路中相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、PARP、caspase-3、caspase-7、caspase-9、Bcl-2和Bax的表達(dá)，DCFH-DA熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　結(jié)果:首先發(fā)現(xiàn)E-1'-O

4、I對HeLa、HCT116和HepG2細(xì)胞均呈現(xiàn)較為明顯的增殖抑制作用。其中，HepG2細(xì)胞對于E-1'-OI反應(yīng)更為敏感。細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，E-1'-OI可以時間濃度依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的增殖。其次，E-1'-OI(40 mg/kg)不僅能夠抑制HepS移植瘤體積的增大，而且能夠減輕腫瘤重量，對HepS移植瘤的抑制率為59.40％，其抗腫瘤效應(yīng)接近陽性對照藥5-FU(抑制率為56.55％)，明顯高于靛玉紅(40 mg

5、/kg)（抑制率僅為5.60％）。除此之外，TUNEL分析實驗的結(jié)果表明，E-1'-OI能夠誘導(dǎo)HepS移植瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在HepS移植瘤中，E-1'-OI通過誘導(dǎo)PARP蛋白出現(xiàn)裂解，降低caspase-3前體蛋白procaspase-3的水平發(fā)揮其在體誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的作用。再者，在western blot實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與對照組和靛玉紅處理組(40 mg/kg)相比，E-1'-OI處理組的PCNA和p-STAT3蛋白表達(dá)

6、水平呈濃度依賴性降低。這一實驗結(jié)果與免疫組化分析的結(jié)果一致，均表明E-1'-OI可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。E-1'-OI不僅對荷瘤小鼠的體重未產(chǎn)生明顯影響，而且未顯示出明顯的免疫抑制毒性。在培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞上還觀察到E-1'-OI和陽性對照藥紫杉醇一樣均可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞出現(xiàn)G2/M阻滯。在10、20和40μM E-1'-OI作用下，HepG2細(xì)胞早期凋亡率由3.1％分別上升至7.0％、33.6％和82.5％。隨著E-1'-OI給藥

7、濃度的增加，細(xì)胞的早期凋亡率呈上升趨勢。在E-1'-OI誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡這一過程中，同時還出現(xiàn)了HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的降低和細(xì)胞色素C由線粒體釋放至胞漿的現(xiàn)象。隨著E-1'-OI給藥濃度的增高，除了PARP蛋白出現(xiàn)裂解，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中的凋亡執(zhí)行蛋白——caspase-9、caspase-7、caspase-3均裂解為活性片段。再者，用E-1'-OI處理細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，隨著給藥濃度的增高，促凋亡蛋白Ba

8、x的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低。還發(fā)現(xiàn)E-1'-OI會誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平上升。但是，當(dāng)用ROS清除劑NAC(N-acetyl cysteine)作用于給藥細(xì)胞后，可部分逆轉(zhuǎn)40μM E-1'-OI所引起的細(xì)胞增殖抑制和線粒體膜電位降低。除此之外，NAC能夠部分降低由40μM E-1'-OI所誘導(dǎo)的PARP的裂解和Bax的蛋白表達(dá)，可以逆轉(zhuǎn)procaspas