溫熱應激調節(jié)自噬性死亡增強結直腸癌細胞SW480對放療的敏感性.pdf

1、第一部分溫熱應激通過促進細胞產(chǎn)生ROS增強結直腸癌細胞SW480對放療的敏感性研究
　　結直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時已處于進展期，臨床療效較差[1,2]。放療在結直腸癌的綜合治療中起著越來越重要的作用，術前放療可提高結直腸癌患者的手術根治切除率，提高低位結腸癌患者的保肛率，減少術后局部復發(fā)的機會[3-5]。然而，由于腫瘤細胞對放療敏感性的差異，放療的效果也不同，部分接受手術及術前輔助放療的患者仍然容易出現(xiàn)復

2、發(fā)轉移[6]。臨床研究表明，熱療可增強放療對結直腸癌細胞的殺傷作用，提高結直腸癌的放療療效，但其確切的機制尚不明確[7-9]。本課題通過細胞實驗及動物模型實驗研究溫熱應激促進腫瘤細胞產(chǎn)生活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)增強結直腸癌細胞對放療的敏感性，探討溫熱應激對放療的增敏作用機制。
　　目的：
　　研究溫熱應激通過促進腫瘤細胞產(chǎn)生ROS增強結直腸癌細胞SW480對放療的敏感性在殺傷腫瘤細胞中的

3、作用。
　　方法：
　　1.細胞實驗：將結直腸癌細胞SW480分為5組：①空白對照組；②熱療組（43℃）；③放療組（6Gy）；④熱療+放療組（43℃+6Gy）；⑤熱療+放療+N-乙酰半胱氨酸組（43℃+6Gy+NAC）。各組細胞處理完成后，光學顯微鏡觀察各組細胞的生長狀態(tài)；流式雙染檢測各組細胞的凋亡情況、應用流式細胞儀（FCMs）檢測各組細胞內(nèi)ROS的含量及線粒體膜電位。
　　2.動物實驗：構建裸鼠左腹股溝皮下移植瘤模

4、型，然后將成功構建左腹股溝皮下移植瘤的裸鼠隨機分為5組，每組六只（n=6），分別為：①control組；②熱療組；③放療組；④熱療+放療組；⑤熱療+放療+N-乙酰半胱氨酸（NAC）組。實驗結束后采用頸椎脫臼法處死實驗小鼠，切除腫瘤組織，測量腫瘤體積大小的改變情況，一部分腫瘤組織采用TUNEL觀察腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡情況；另一部分制成細胞懸液，F(xiàn)CMs檢測各組腫瘤細胞內(nèi)ROS的含量及線粒體膜電位。
　　結果：
　　1.顯微鏡下觀

5、察不同處理對細胞的殺傷效果，結果表明：與對照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細胞均出現(xiàn)不同程度的生長速度緩滯，細胞形態(tài)傾向于梭形或變圓，并且出現(xiàn)漂浮的死亡細胞；直觀的觀察到不同處理對細胞的殺傷效果，其中放療組出現(xiàn)漂浮死亡的細胞多于熱療組；熱療+放療組細胞生長最慢，漂浮死亡的細胞數(shù)最多；熱療+放療+NAC組出現(xiàn)漂浮死亡的細胞與熱療+放療組相比有所減少。
　　2.流式雙染檢測各組細胞的凋亡情況，結果顯示：與對

6、照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組各種處理均能促進細胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組細胞的凋亡率高于熱療組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組細胞的凋亡率明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。熱療+放療+NAC組細胞的凋亡率低于熱療+放療組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　3.FCMs檢測各組細胞內(nèi)ROS水平，結果顯示：與對照組相比

7、，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細胞內(nèi)ROS水平出現(xiàn)不同程度升高，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組細胞內(nèi)ROS水平高于熱療組，兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組細胞內(nèi)ROS水平明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組ROS的水平與熱療+放療組相比明顯降低，兩組間比較有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。
　　4.FCMs檢測各組細胞線粒體膜電位的變化，結果顯示

8、：與對照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組細胞線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度下降，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組細胞線粒體膜電位下降水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組細胞內(nèi)線粒體膜電位下降程度最明顯，明顯高于其它組，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組細胞線粒體膜電位下降水平低于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　5.游標卡尺測量各

9、組裸鼠移植瘤體積變化，結果顯示：接種結直腸癌SW480細胞12天后裸鼠皮下移植瘤體積可達到500mm3，之后各組給予不同處理，每三天測量一次裸鼠移植瘤體積，與對照組相比，放療組、熱療組、熱療+放療組及熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤體積增長出現(xiàn)不同程度減慢，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤體積小于熱療組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組移植瘤體積小于其它各組，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療+

10、NAC組移植瘤大于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　6.FCMs檢測各組裸鼠移植瘤細胞內(nèi)ROS水平，結果與細胞實驗一致：放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞內(nèi)ROS水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤細胞內(nèi)ROS水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組裸鼠移植瘤細胞內(nèi)ROS水平明顯高于其它組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）

11、；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞內(nèi)ROS水平低于熱療+放療組，兩組間比較有統(tǒng)計學差異（p<0.05）。
　　7.FCMs檢測各組裸鼠移植瘤細胞線粒體膜電位的變化，結果與細胞實驗一致：放療組、熱療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞線粒體膜電位出現(xiàn)不同程度下降，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；放療組裸鼠移植瘤細胞線粒體膜電位下降水平高于熱療組，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療組裸鼠移植瘤細胞線粒體膜

12、電位下降程度最明顯，明顯高于其它組，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞線粒體膜電位下降水平低于熱療+放療組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。
　　8.TUNEL檢測各組裸鼠移植瘤組織細胞凋亡情況，結果表明：熱療組、放療組、熱療+放療組、熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞凋亡水平高于對照組，熱療+放療組裸鼠移植瘤細胞的凋亡水平明顯高于其它組；熱療+放療+NAC組裸鼠移植瘤細胞的凋亡水平低于