BNIP3對結直腸癌化療敏感性影響及其表達調(diào)控研究.pdf

1、結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,化療在其治療手段中占有重要地位。腫瘤細胞對化療藥物的耐受嚴重影響了化療效果,其中凋亡通路的障礙是導致腫瘤細胞對化療藥物耐受的重要原因之一。Bcl-2家族蛋白是介導化學藥物等細胞毒性信號刺激引起內(nèi)源性凋亡途徑的重要蛋白。當細胞受到這些信號刺激時,細胞是否凋亡很大程度上取決于Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白力量的平衡。
　　 BNIP3(Bcl

2、-2/adenovirus E1B19 kDa-interacting protein3)是Bcl-2家族中重要的促凋亡成員,它通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1等形成異二聚體而拮抗其功能,或直接作用于線粒體外膜導致線粒體功能障礙,從而引起細胞凋亡(apoptosis)。此外,BNIP3還可以誘導細胞發(fā)生壞死樣(necrosis-like)死亡和自噬性(autophagy)死亡。BNIP3在結直腸癌、胰腺癌和部分血液系統(tǒng)惡性腫瘤中

3、表達降低或缺失,而且BNIP3的表達降低或缺失與胰腺癌對化療抵抗有關。這提示,BNIP3的失活可能是導致惡性腫瘤細胞凋亡信號通路受阻、逃逸化療藥物誘導的細胞凋亡,從而對化療藥物產(chǎn)生耐受的重要因素之一。但是,BNIP3的表達對結直腸癌化療敏感性的確切影響尚不清楚。
　　 BNIP3的表達沉默受基因啟動子異常甲基化調(diào)控。DNA甲基化由DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成,具有催化甲基化功能

4、的主要的DNMT有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b。BNIP3表達沉默的腫瘤細胞用DNA甲基轉移酶抑制劑5-雜氮脫氧胞嘧啶(5-aza-deoxycytidine,5-aza-dC)處理,可恢復BNIP3的表達。因此,有望通過采用去甲基化手段,恢復BNIP3表達,促進細胞凋亡,增加結直腸癌等BNIP3表達沉默的腫瘤對化療藥物的敏感性。但是DNA甲基轉移酶抑制劑由于在DNA合成過程中摻入DNA,可能導致DNA損傷而存在廣泛的細胞毒性

5、,以及治療的非特異性而限制了其應用。
　　 RNA干擾是近年發(fā)展起來的使靶基因沉默的一種技術,它主要通過降解靶基因mRNA來實現(xiàn)敲除或失活相應基因的目的,具有良好的特異性及干擾效果,在臨床靶向治療中有著良好的應用前景。既往研究證實,應用RNA干擾手段單獨抑制DNMT1表達或聯(lián)合沉默DNMT1和DNMT3b的表達可以使腫瘤細胞高甲基化的抑癌基因啟動子將不同程度地去甲基化,受甲基化控制的抑癌基因將得到不同程度的表達。但是干擾DNMT

6、s對BNIP3基因的去甲基化作用以及對結腸癌化療敏感性的影響目前尚不清楚。
　　 本文擬通過檢測結直腸癌組織標本BNIP3的表達并分析其與臨床化療療效的相關性,通過干擾結腸癌細胞株BNIP3表達,觀察結腸癌細胞增殖、藥物誘導的細胞凋亡和化療敏感性的變化,以進一步探討B(tài)NIP3對結直腸癌化療的確切影響;擬通過檢測結腸癌細胞株BNIP3基因啟動子甲基化狀態(tài)證實基因啟動子異常甲基化是導致BNIP3沉默的重要機機制,應用RNAi技術干擾

7、DNMT1和DNMT3b的表達,檢測BNIP3的表達和甲基化狀態(tài)的改變,以及結腸癌細胞增殖、凋亡和化療敏感性的變化,以進一步探討RNA干擾DNMT1和DNMT3b的表達能否通過去甲基化作用恢復BNIP3的表達,增加結腸癌細胞的化療敏感性。
　　 方法
　　 1、應用免疫組織化學方法檢測81例應用“奧沙利鉑聯(lián)合5-Fu/CF”方案化療的晚期結直腸癌患者腫瘤組織和遠殘端正常結直腸組織標本BNIP3的表達。
　　 2、

8、采用RT-PCR和Western印跡法檢測八種人結腸癌細胞株BNIP3基因mRNA和蛋白表達。
　　 3、構建靶向BNIP3基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達載體(pGCsi3.0-BNIP3),轉染結腸癌LoVo細胞,篩選穩(wěn)定表達克隆。
　　 4、采用RT-PCR和Western印跡法檢測DNMT1和DNMT3b在八種人結腸癌細胞株的表達。
　　 5、選擇DNMT1和D

9、NMT3b高表達而BNIP3表達沉默的結腸癌HT-29細胞作為細胞模型,單獨或聯(lián)合轉染化學合成DNMT1 siRNA和DNMT3b siRNA,并用DNMT抑制劑5-aza-dC作為陽性對照。
　　 結果
　　 1、結直腸腫瘤組織中的BNIP3免疫積分顯著低于正常結直腸組織(1.8±8).2v3.7±0.5,P＜0.05)。腫瘤組織BNIP3的表達與HIF-1α表達無相關性。
　　 2、在人結腸癌八種細胞株中HC

10、T-116、LS174T和LoVo三種細胞有明顯BNIP3表達,低氧處理24h后BNIP3的表達較常氧培養(yǎng)條件下明顯增強。
　　 3、RNAi技術可特異性沉默LoVo細胞BNIP3基因表達,mRNA和蛋白水平表達抑制率分別為73.1％和75.4％。
　　 4、抑制BNIP3基因表達使LoVo細胞體外生長增殖速度明顯加快。與對照組LoVo細胞相比,BNIP3 RNAi的LoVo細胞5-FU誘導的細胞凋亡率顯著減少(8.35

11、±0.46v19.75±2.37,P＜0.05),5-FU作用的IC50值顯著增高(108.4±4.69ug/mlv50.08±2.85μg/ml,P＜0.05)。
　　 5、DNMT1在八種人結腸癌細胞株中均高表達,DNMT3b差異性明顯表達。
　　 6、應用siRNA可特異性沉默HT-29細胞DNMT1和DNMT3b基因表達,蛋白水平表達抑制率分別為76.0％和71.1％。
　　 7、單獨應用DNMT1siR

12、NA和聯(lián)合應用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA使BNIP3基因啟動子去甲基化,誘導BNIP3的表達。聯(lián)合應用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA較單獨應用DNMT1siRNA的作用更顯著,聯(lián)合應用與1uM5-aza-dC作用相當。而單獨應用DNMT3BsiRNA和陰性對照組HT-29細胞BNIP3基因啟動子甲基化狀態(tài)和BNIP3的表達無明顯影響。
　　 8、單獨應用DNMT1siRNA和聯(lián)合應用DNM

13、T1 siRNA、DNMT3b siRNA使HT-29細胞體外克隆形成能力明顯下降,細胞克隆形成率分別為(15.4±3.7)％和(2.1±0.43)％,與陰性對照組(25.8±5.1)％比較有顯著差異。與陰性對照組HT-29細胞相比,單獨應用DNMT1siRNA和聯(lián)合應用DNMT1siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29細胞其G0/G1期細胞數(shù)分別增加21.72％and28.33％,S期的細胞數(shù)分別減少30.86％and44.5

14、6％,細胞凋亡率分別增加6.1 and13.34倍(P＜0.05)。與陰性對照組HT-29細胞IC50值比較,單獨應用DNMT1siRNA和聯(lián)合應用DNMT1 siRNA、DNMT3b siRNA的HT-29細胞5-FU的IC50值均顯著降低(171.5±15.20μg/mlv376.5±33.69μg/ml,45.54±12.88μg/ml v376.5±33.69μg/ml,P均＜0.05)。聯(lián)合應用DNMT1 siRNA、DNMT

15、3b siRNA組的HT-29細胞克隆形成能力、細胞凋亡率和5-Fu的IC50值的改變較單獨轉染DNMT1 siRNA組均更顯著(JP均＜0.05)。單獨應用DNMT3b siRNA和陰性對照對HT-29細胞克隆形成能力、細胞凋亡率和5-FU的IC50值均無顯著改變。
　　 結論
　　 1.BNIP3在結腸癌組織和細胞中表達降低或沉默,基因啟動子異常甲基化是BNIP3表達下調(diào)的重要原因。
　　 2.BNIP3表達

16、與晚期結直腸癌患者FOLFOX方案化療療效相關。阻斷結腸癌細胞BNIP3基因表達,可通過促進細胞增殖,減少5-Fu藥物誘導的細胞凋亡,來降低結腸癌細胞對5-FU的敏感性。這提示BNIP3可能是結直腸癌治療的潛在靶點。
　　 3.RNAi技術可特異性抑制DNMT1和DNMT3b基因表達。雙重干擾DNMT1、DNMT3b表達或單獨干擾DNMT1表達可通過基因啟動子去甲基化作用誘導HT-29細胞BNIP3表達,同時還可降低HT-29細