反義microRNA-221對結(jié)直腸癌細胞放射敏感性的影響及相關(guān)機制.pdf

1、南方醫(yī)科大學2010級碩士學位論文反義microRNA221對結(jié)直腸癌細胞放射敏感性的影響及相關(guān)機制EffectofAntisenseMicroRNA一221onRadiationSensitivityofColorectalCancerCellsandtheUnderlyingMechanism課題來源：國家自然科學基金青年科學基金項目(81101896)；廣東省科技計劃項目(20128031800141)；廣東省醫(yī)學科研基金(B20

2、12221)；學位申請人導師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學院張曉檳吳承堂外科學(普通外科)全日制學術(shù)型碩士研究生第一臨床醫(yī)學院2013年05月16日廣州中文摘要4Gy、6Gy、8Gy照射劑量下的細胞存活分數(shù)(SF)和增殖性死亡的增殖比，初步探討miR一221反義寡聚核苷酸(ASmiR221)能否發(fā)揮結(jié)直腸癌放射增敏作用及其機制。實驗方法：(1)常規(guī)體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌Cac02細胞系，用不同劑量X射線(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)進

3、行照射(采用美國瓦里安600直線加速器6MVX線進行一次性照射，輻射時培養(yǎng)板上加蓋2am厚有機玻璃板使細胞處在劑量建成區(qū)下相對均勻區(qū)，源皮距為100cm，劑量率為32Gy／min)，24小時后提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)，采用RealTimeQPCR檢測細胞中miR221和p57h必mRNA的表達水平，Western—blot檢測p57H加蛋白的表達水平，了解結(jié)直腸癌細胞在放射治療的應(yīng)激狀態(tài)下miR221及其調(diào)控靶基因p57H坤的表達變化規(guī)

4、律，初步評價miR221／p57H嵋信號通路在結(jié)直腸癌放療中的作用及臨床意義。(2)利用Lipofectamine疆轉(zhuǎn)染反義miR221(ASmiR221)序列，同時設(shè)置空白對照組及陰性對照組，利用RealTimeQPCR和Western—blot技術(shù)檢測干擾后miR221和p57H啦基因的表達情況；利用克隆形成實驗計算各實驗組細胞在不同照射劑量下的存活分數(shù)和增殖性死亡的增敏比，同時單擊多靶模型擬合計算出三組細胞的平均致死劑量D。值和準

5、域劑量Dq值，評價抑制miR221基因表達后對Cac02細胞放射敏感性的影響；繼而預先轉(zhuǎn)染p57干擾siRNA(p57siRNA)，再經(jīng)AS—miR一221轉(zhuǎn)染，將AS—miR一221聯(lián)合p57一siRNA轉(zhuǎn)染的Cac02細胞(設(shè)立p57一NCsiRNA為陰性對照組)在中位劑量4Gy下進行照射，通過克隆形成實驗計算細胞的存活分數(shù)，與AS—miR一221組進行對照，初步評價抑制miR221的表達對Cac02細胞放射敏感性影響的機制。(3)