轉(zhuǎn)錄因子NFIC在人根尖牙乳頭干細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、干細(xì)胞在組織工程學(xué)中的運(yùn)用將為牙髓/牙本質(zhì)再生和生物性牙根的形成提供廣闊的運(yùn)用前景。根尖牙乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla,SCAPs)位于未發(fā)育完成的年輕恒牙的根尖部,是一種取自正在發(fā)育組織的成體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。SCAPs具有多向分化的潛能,在特定培養(yǎng)液誘導(dǎo)下可形成類牙髓/牙本質(zhì),且被認(rèn)為是牙根部成牙本質(zhì)細(xì)胞的來源,最終形成牙根部牙

2、本質(zhì)。SCAPs與牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)相比,具有較強(qiáng)的成牙分化能力和較低的免疫原形,此特性被認(rèn)為更適合運(yùn)用于骨/牙體組織再生領(lǐng)域。
　　核轉(zhuǎn)錄因子NFIC(nuclear factor I-C)在調(diào)控牙根的發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。敲除NFIC的小鼠,形成短小的磨牙牙根,而牙冠發(fā)育正常。鑒于NFIC是特異性調(diào)控牙根發(fā)育的信號(hào)分子,而SCAPs是牙根成牙本質(zhì)細(xì)胞的來源,那么,NFIC在調(diào)

3、控SCAPs分化中的作用及其機(jī)制如何,目前尚不清楚。
　　牙齒的發(fā)育是由一系列上皮和間充質(zhì)相互作用而形成,眾多的細(xì)胞因子參與了牙齒發(fā)育的調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,包括TGF-βs,骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)和激活素類等相關(guān)蛋白,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和胚胎發(fā)育等。研究發(fā)現(xiàn)NFIC通過抑制TG

4、F-β1調(diào)控的基因表達(dá),影響皮膚傷口的愈合;敲除NFIC后,小鼠異常的成牙本質(zhì)細(xì)胞中TGF-βⅠ型受體和磷酸化的Smad2/3顯著上調(diào),提示,NFIC可能參與TGF-β信號(hào)通路,但是兩者是在調(diào)控SCAPs分化中的作用機(jī)制尚不清楚。
　　本課題首先成功分離、培養(yǎng)和鑒定人根尖牙乳頭干細(xì)胞。隨后分別轉(zhuǎn)染所構(gòu)建的慢病毒NFIC真核表達(dá)載體或沉默NFIC的siRNA。通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)觀察NFIC對(duì)SCAPs增殖、分化的影響。最后,研究TGF

5、-β1對(duì)SCAPs生物學(xué)特性及分化的影響,討論NFIC與TGF-β1信號(hào)通路在SCAPs分化中的相互作用。為將來SCAPs在牙髓牙本質(zhì)再生和生物性牙根方面的應(yīng)用提供新的思路。
　　結(jié)果如下:
　　1.人根尖牙乳頭感干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　選取因正畸原因而拔除的年輕患者第三磨牙,分離培養(yǎng)人原代SCAPs,有限稀釋法純化獲得單克隆的細(xì)胞;免疫組織化學(xué)染色及流式細(xì)胞儀鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物STRO-1等;成骨誘導(dǎo)、成脂

6、誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞的多向分化能力。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子NFIC促進(jìn)SCAPs分化能力
　　構(gòu)建NFIC慢病毒真核表達(dá)載體plenti-NFIC后,與沉默NFIC的siRNA分別轉(zhuǎn)染SCAPs。過表達(dá)NFIC還促進(jìn)SCAPs的增殖能力、ALP活性和成骨/牙分化能力。此外,NFIC還不同程度地增強(qiáng)礦化基因標(biāo)記物ALP、OCN和Col.I的mRNA;蛋白質(zhì)印跡免疫檢測(cè)技術(shù)也證實(shí)NFIC上調(diào)DSP蛋白水平。而沉默NFIC,則明顯抑制SC

7、APs礦化能力及礦化基因ALP、OCN和Col.I的表達(dá)。此外,過表達(dá)NFIC增強(qiáng)脂滴的形成和成脂標(biāo)記物CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)C/EBP-β、C/EBP-δ和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor-y,PPAR-γ)的表達(dá)。
　　體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí):過表達(dá)NFIC的SCAPs細(xì)胞復(fù)合膠原/煅燒牛

8、骨(calcined bovine bone,CBB)材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下12周后,可促進(jìn)形成類成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子NFIC參與TGF-β1信號(hào)通路對(duì)SCAPs的調(diào)控
　　不同濃度TGF-β1均抑制SCAPs增殖和體外礦化結(jié)節(jié)形成,并下調(diào)礦化基因的表達(dá),而分別應(yīng)用TGF-β1Ⅰ型受體抑制劑SB431542和Smad3的抑制劑SIS3阻斷TGF-β信號(hào)通路后,可部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1對(duì)SCAPs

9、增殖和分化的抑制作用。TGF-β1抑制NFIC蛋白的表達(dá),過表達(dá)NFIC減弱TGF-β1對(duì)SCAPs礦化能力的抑制作用,而沉默NFIC則增強(qiáng)了TGF-β1對(duì)SCAPs成牙/骨的分化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NFIC參與TGF-β1信號(hào)通路對(duì)SCAPs的生物學(xué)調(diào)控。
　　綜上所述,本研究通過體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NFIC可以促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞的增殖和分化能力;而TGF-β1則起抑制作用;且NFIC參與了TGF-β1對(duì)根尖牙乳頭干細(xì)胞分化特性的調(diào)