單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)鴨乙型肝炎病毒DNA的水平及動(dòng)態(tài)變化.pdf

1、研究背景、目的及意義:
　　 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制模板，長(zhǎng)期穩(wěn)定的以微染色體的形式存在于受感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，雖其含量遠(yuǎn)低于HBV存在的一般形式松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，但對(duì)HBV的復(fù)制和感染狀態(tài)的建立具有舉足輕重的意義。cccDNA是HBV感染狀態(tài)的持續(xù)、停用抗病毒藥物后病情反復(fù)及藥物耐藥的關(guān)鍵因素，因此只有清除或有效降低細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，才能徹底消除乙肝患者病毒攜帶狀態(tài)，或

2、使病情趨于穩(wěn)定。
　　 cccDNA的定量檢測(cè)對(duì)于理解HBV的復(fù)制和清除，評(píng)估抗病毒藥物的療效和療程等具有重要的意義;但rcDNA或雙鏈線性DNA(dsDNA)的非特異性擴(kuò)增仍然是目前要面臨的主要問題。檢測(cè)方法不成熟和肝組織來源困難在一定程度上阻礙了對(duì)乙肝患者cccDNA的直接研究。
　　 在鴨乙型肝炎病毒(DHBV)感染的鴨肝細(xì)胞，胞核內(nèi)病毒DNA主要是以cccDNA為主，而胞漿內(nèi)作為cccDNA前體的rcDNA可能有

3、其量的10倍。因此定量檢測(cè)核內(nèi)病毒DNA可較直接反映cccDNA的水平。
　　 本研究將在單個(gè)肝細(xì)胞核的層面上定量檢測(cè)慢性DHBV感染狀態(tài)下核內(nèi)病毒DNA水平及其影響因素;通過恩替卡韋短期抑制病毒復(fù)制，觀察血清DHBVDNA陰轉(zhuǎn)時(shí)及陰轉(zhuǎn)后單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)病毒水平及受感染肝細(xì)胞核數(shù)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 研究首次提出了在單個(gè)肝細(xì)胞核的水平上分析核內(nèi)病毒DNA，并通過恩替卡韋抑制病毒復(fù)制觀察核內(nèi)病毒DNA的清除動(dòng)力學(xué)。完成這一研究

4、會(huì)幫助更加深入理解嗜肝DNA病毒的生活周期，病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用，藥物作用下單個(gè)核內(nèi)病毒DNA的清除規(guī)律，同時(shí)也將為下一步研究慢乙肝患者核內(nèi)HBV DNA水平及抗病毒療效評(píng)估等奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 第一部分:建立鴨乙型肝炎病毒后天感染模型篩選
　　 1和58日齡廣東櫻桃谷鴨各20只，在2日及2月齡時(shí)病毒陰性動(dòng)物靜脈接種含1×108 DHBV DNA病毒顆粒的血清。接種后不同時(shí)間點(diǎn)采血，抽提DN

5、A，PCR定性及定量檢測(cè)外周血病毒DNA水平。
　　 第二部分:慢性感染狀態(tài)下單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV DNA水平
　　 1.對(duì)納入的11只45日齡慢性DHBV感染鴨行肝活檢手術(shù)。
　　 2.建立單個(gè)核內(nèi)DHBVDNA定量檢測(cè)方法采用Taqman探針熒光定量PCR法檢測(cè)單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA水平，并驗(yàn)證該方法的敏感性、特異性及批間差異:已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(PBS-DHBV1.2)倍比稀釋為1、10、100、100

6、0和2、20、200、2000 copies/μl。按照50μl的反應(yīng)體系分別向反應(yīng)孔內(nèi)加入1、10、100、1000和2、20、200、2000拷貝數(shù)的PBS-DHBV1.2質(zhì)粒進(jìn)行real-time PCR定量擴(kuò)增，得到擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定方法的敏感性（最低檢測(cè)下限）;分別用含有DHBV、HBV及HCV全基因組的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證引物和探針的特異性;分四批定量檢測(cè)兩只動(dòng)物單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA水平，計(jì)算核內(nèi)病毒拷貝數(shù)的批間差異

7、，用變異系數(shù)(CV％)表示。
　　 3.勻漿研磨5mg肝組織、低速離心、勻漿液充分洗滌得到肝細(xì)胞核懸液、通過流式細(xì)胞儀分選得到單個(gè)細(xì)胞核;單個(gè)細(xì)胞核經(jīng)蛋白酶K消化、EcoRⅠ酶切后，采用熒光定量PCR法檢測(cè)核內(nèi)病毒DNA水平。
　　 4.流式細(xì)胞儀分選105個(gè)肝細(xì)胞核至1ml的PBS溶液中、提取總的核內(nèi)DNA，采用熒光定量PCR法檢測(cè)總的核內(nèi)病毒DNA水平。
　　 5.細(xì)胞周期檢測(cè)并分選處在不同周期的單個(gè)核500

8、μl的肝細(xì)胞核懸液（約1×105個(gè)核）中加入15μl PI(100μg/ml)染色液，避光室溫孵育至少30min;流式細(xì)胞儀將根據(jù)核內(nèi)DNA的量確定細(xì)胞周期的分布狀況，并分選處在不同細(xì)胞周期的單個(gè)核至96孔板中。
　　 6.明確整合的病毒DNA影響質(zhì)粒安全ATP依賴的DNA酶(PSAD)可以選擇性消化線性DNA（即整合的片段），對(duì)cccDNA和rcDNA無影響。單個(gè)核內(nèi)病毒DNA在1個(gè)單位PSAD酶的作用下37℃孵育30min，

9、然后70℃、30min滅活該酶;再加入5個(gè)單位的EcoRⅠ，37℃孵育30 min。采用熒光定量PCR法檢測(cè)單個(gè)核內(nèi)病毒DNA水平，確定病毒陽性細(xì)胞核數(shù)，比較PSAD處理組與未處理組間的差異。
　　 7.病毒DNA在肝內(nèi)的存在形式采用酚-氯仿抽提法提取肝細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及肝細(xì)胞內(nèi)的總DNA，Southernblot印跡雜交檢測(cè)病毒DNA的存在形式。
　　 第三部分:恩替卡韋治療對(duì)單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA的影響
　　

10、 實(shí)驗(yàn)分組:將11只45日齡慢性DHBV感染鴨隨機(jī)分兩組:恩替卡韋治療組(n=6)和未治療組(n=5)。
　　 治療組每只動(dòng)物每日接受0.5mg恩替卡韋抗病毒，血清DHBV DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，行第二次肝活檢;陰轉(zhuǎn)后繼續(xù)給藥治療16周，治療結(jié)束時(shí)處死所用動(dòng)物，取出肝組織標(biāo)本。
　　 觀察單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA水平及受感染肝細(xì)胞核數(shù)的動(dòng)態(tài)變化。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料組間比較采

11、用Pearson'schi-square檢驗(yàn)，對(duì)理論頻數(shù)小于5的四格表資料采用Fisher精確概率法。連續(xù)變量之間的相關(guān)性應(yīng)用Pearson方法。計(jì)量資料若滿足正態(tài)分布或方差齊性采用參數(shù)檢驗(yàn)方法（兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)）;計(jì)量資料若不滿足正態(tài)分布及方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法（Mann-Whitney U檢驗(yàn)）。計(jì)量資料多組間整體比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。因無法觀察同一個(gè)肝細(xì)胞核在不同時(shí)間點(diǎn)或酶處理前后的變化，因此不采用配

12、對(duì)比較。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 第一部分:建立鴨乙型肝炎病毒后天感染模型
　　 篩選出4只58日齡和2只1日齡血清DHBV DNA陽性鴨，感染率分別為20％和10％。
　　 兩組血清病毒陰性動(dòng)物在2月齡或2日齡時(shí)靜脈接種含1×108 DHBV DNA病毒顆粒的血清。2月齡動(dòng)物在接種后兩個(gè)月內(nèi)均未產(chǎn)生可檢測(cè)的病毒血癥，后天感染率為0，提示在成鴨中較

13、難建立鴨乙型肝炎病毒后天感染模型。2日齡動(dòng)物在接種后第14天，78.6％的動(dòng)物可檢出病毒血癥，血清DHBV DNA水平在108 copies/ml左右，隨后觀察的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，血清病毒載量均維持在107～109copies/ml之間。
　　 第二部分:慢性感染狀態(tài)下單個(gè)肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV DNA水平
　　 成功建立單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA定量檢測(cè)方法將含有DHBV、HBV和HCV全基因組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)除了

14、DHBV質(zhì)粒能成功擴(kuò)增外，其余質(zhì)粒均未產(chǎn)生熒光信號(hào)，無假陽性擴(kuò)增，提示引物和探針的特異性好。
　　 分別用1、2、10和20拷貝的PBS-DHBV1.2質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)除了1拷貝的質(zhì)粒不能被有效擴(kuò)增外，其余均能檢出。兩次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)均取得相一致結(jié)果:單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA最低定量檢測(cè)下限(Low Limit ofDetection，LLOD)為2拷貝。
　　 分四批定量檢測(cè)兩只動(dòng)物單個(gè)核內(nèi)DHBV DN

15、A水平，批間變異系數(shù)(CV％)分別為2.42％和6.92％。
　　 單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA水平慢性感染狀態(tài)下，不是所有肝細(xì)胞核均受感染(63.3％-93.3％)。核與核之間病毒拷貝數(shù)差異較大(2-204)。Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)病毒DNA平均拷貝數(shù)(7.57-57.67)與核內(nèi)總的病毒載量(r=0.927，P＜0.001)和血清病毒水平呈正相關(guān)。
　　 核內(nèi)DHBV DNA水平與細(xì)胞周期有關(guān)流式細(xì)胞儀對(duì)3只

16、45日齡動(dòng)物行細(xì)胞周期檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)分別有75％、81％、79％的肝細(xì)胞核處在G0/1期，15％、11％、10％的核處在S期，10％、8％、11％的核處于G2/M期。
　　 細(xì)胞周期間病毒陽性核拷貝數(shù)整體比較有顯著性差異，G0/1期最高，其次是G2/M和S期;陽性細(xì)胞核比率整體比較也有顯著性差異，S期陽性細(xì)胞核比率最低，約一半的陽性核病毒拷貝數(shù)低于10。
　　 PSAD酶處理對(duì)核內(nèi)DHBV DNA水平影響較小PSAD酶處理組

17、與未處理組相比較，各動(dòng)物病毒陽性核拷貝數(shù)均未見有顯著變化:動(dòng)物編號(hào)22(Z=-0.810，P=0.418)，51(Z=-0.352，P=0.725)，52(Z=-1.837，P=0.066)，62(Z=-0.321，P=0.748)，65(Z=-1.041，P=0.298);各動(dòng)物病毒陽性核比率也未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義改變:動(dòng)物編號(hào)22(x2=0.098，P=0.075)，51(x2=0.351，P=0.554),52(x2=0.741, P

18、=0.389),62(x2=0.480, P=0.488),65(x2=1.071, P=0.301)。
　　 核內(nèi)DHBV DNA主要是以cccDNA的形式存在Southern blot結(jié)果顯示肝細(xì)胞核內(nèi)DHBV DNA主要以cccDNA的形式存在，也可見有少量rcDNA;胞質(zhì)中病毒DNA以rcDNA，dsDNA和ssDNA的形式存在。
　　 第三部分:恩替卡韋治療對(duì)單個(gè)核內(nèi)DHBVDNA的影響
　　 恩替卡韋

19、治療對(duì)病毒陽性肝細(xì)胞核比率的影響恩替卡韋抗病毒治療能顯著降低病毒陽性肝細(xì)胞核比率。陽性率下降主要發(fā)生在從基線至血清病毒DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，延長(zhǎng)治療過程中陽性率下降仍較明顯。
　　 從基線至血清病毒DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，恩替卡韋治療組動(dòng)物陽性肝細(xì)胞核比率明顯降低;未治療組陽性率未發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義改變。
　　 從血清病毒DNA陰轉(zhuǎn)至治療結(jié)束，恩替卡韋治療組動(dòng)物陽性肝細(xì)胞核比率明顯降低;未治療組陽性率未發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義改變。
　　

20、恩替卡韋治療對(duì)單個(gè)核內(nèi)DHBVDNA水平的影響血清病毒DNA陰轉(zhuǎn)時(shí)，恩替卡韋治療組動(dòng)物病毒陽性核拷貝數(shù)明顯低于基線時(shí)水平;未治療組病毒陽性核拷貝數(shù)未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義改變。對(duì)每只動(dòng)物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)治療組中除了9號(hào)(Z=-1.745，P=0.081)，52號(hào)(t=1.479，P=0.148)動(dòng)物病毒陽性核拷貝數(shù)無明顯變化外，其余均明顯降低。
　　 從血清病毒DNA陰轉(zhuǎn)至治療結(jié)束，核內(nèi)病毒DNA平均拷貝數(shù)緩慢降低，但個(gè)別核內(nèi)病毒水平仍較

21、高。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功建立單個(gè)核內(nèi)DHBVDNA定量檢測(cè)方法，該方法具有較理想的敏感性及特異性。
　　 2.慢性感染狀態(tài)下單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA拷貝數(shù)相差較大，核內(nèi)DHBV DNA平均拷貝數(shù)與血清病毒水平及核內(nèi)總的病毒載量正相關(guān)。
　　 3.單個(gè)核內(nèi)DHBV DNA水平與細(xì)胞周期狀態(tài)有關(guān)。病毒在G0/1期復(fù)制活躍，其次是G2/M和S期。
　　 4.抗病毒治療能有效降低單個(gè)核內(nèi)D