動物腸道源抗鉛益生乳酸菌的分離、鑒定及其緩解鉛毒性的機(jī)理研究.pdf

1、鉛(Lead，Pb)作為地球上分布廣泛且含量豐富的重金屬之一，同時也是最嚴(yán)重的環(huán)境污染物。鉛屬于機(jī)體非必需元素，尚未證實(shí)其具有營養(yǎng)性，但對機(jī)體的積累性毒害作用被廣泛認(rèn)同。鉛蓄積在體內(nèi)，可造成神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和造血等方面功能障礙，引起腦、腎、肝和神經(jīng)等損傷。近年來，許多國家，尤其發(fā)展中國家，鉛污染和鉛中毒已成為廣泛關(guān)注的公共健康問題。常規(guī)的螯合劑治療和新興起的營養(yǎng)干預(yù)治療方法，存在具有明顯副作用并且影響必需金屬元素等弊端，所以

2、，尋找一些新的策略對鉛中毒，開發(fā)安全、有效、無毒副作用、綠色的新型解毒制劑或膳食補(bǔ)充劑將成為一種必然趨勢。在治理重金屬污染水源和土壤的領(lǐng)域，微生物吸附法因其操作簡易、清除效率高、來源豐富、成本低、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢而得到青睞和應(yīng)用，能否應(yīng)用微生物清除或緩解人或動物重金屬毒性值得深入探討。作為公認(rèn)的食品安全級微生物，已有報道顯示乳酸菌可以高效吸附重金屬鉛離子，緩解鉛的毒性作用，但作用機(jī)制尚未完全明確。所以，本課題旨在篩選多種動物腸道來源能夠在

3、體外耐受重金屬鉛離子，并且具有優(yōu)良益生性質(zhì)的乳酸菌;進(jìn)一步通過建立動物模型驗(yàn)證其在體內(nèi)的功能，研究其緩解重金屬鉛中毒的作用機(jī)理，為開發(fā)利用乳酸菌作為重金屬清除劑添加到動物飼料或食品中奠定理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。以下為主要研究結(jié)果:
　　首先，利用含Pb2+MRS固體培養(yǎng)基，從多種健康動物腸道分離乳酸菌，通過革蘭氏染色、形態(tài)觀察、觸酶試驗(yàn)的初步篩選，共得到38株符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株。這些菌株均具有很強(qiáng)的鉛耐受能力，最大耐受鉛離子濃度可達(dá)到2000

4、 mg/L;在600 mg/L鉛離子溶液中，對鉛吸附率均在60％以上，最高可到84％。進(jìn)而，模擬體外胃腸道環(huán)境，進(jìn)行耐受強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、膽鹽和胰蛋白酶的測定，篩選出20株符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株，其中的5株對常見的五種病原菌具有良好的抑制效果。隨之，對這5株具有優(yōu)良益生性質(zhì)的菌株進(jìn)行16S rRNA鑒定，確定菌株分別是羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、嗜淀粉乳桿菌(La

5、ctobacillus amylovorus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。最后，測定對清除羥自由基、清除DPPH自由基以及還原能力，證實(shí)這5株乳酸菌具有一定的抗氧化能力。其中，羅伊氏乳桿菌21008菌株鉛耐受能力和吸附能力、益生性質(zhì)、體外抗氧化能力表現(xiàn)最為突出，所以，選擇羅伊氏乳桿菌21008菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
　　之后，通過建立重金屬鉛急性中毒小鼠模型，評價口服羅伊氏乳桿菌21008對鉛中毒的緩解效果，

6、并解析其緩解鉛毒性的機(jī)制。分別設(shè)立對照組、LAB-5d組（先灌喂5d乳酸菌，之后染毒）、MRS-5d組（先灌喂5d MRS，之后染毒）、LAB-12d組（先灌喂5d乳酸菌，之后染毒，并持續(xù)灌喂乳酸菌12d）和MRS-12d組（先灌喂5d MRS，之后染毒，并持續(xù)灌喂MRS12d），檢測肝臟、腎臟和糞便中鉛的含量，組織病理學(xué)變化的觀察，氧化應(yīng)激檢測，檢測相關(guān)mRNA表達(dá)水平和炎癥相關(guān)信號通路的蛋白表達(dá)水平，通過這些指標(biāo)對灌喂羅伊氏乳桿菌2

7、1008緩解鉛毒性的機(jī)制進(jìn)行探究。結(jié)果表明，灌喂羅伊氏乳桿菌21008能明顯緩解急性鉛中毒小鼠體重降低，減輕急性鉛毒性導(dǎo)致的機(jī)體病理損傷，保護(hù)小鼠腸道粘膜屏障。灌喂羅伊氏乳桿菌21008不但能夠降低肝臟和腎臟中鉛的含量，還能促進(jìn)鉛隨糞便排出，從而抑制腸道對鉛的吸收，保護(hù)腸道免受鉛毒性引起的病理損傷。同時，羅伊氏乳桿菌21008可以緩解鉛中毒引起的氧化應(yīng)激，促進(jìn)有關(guān)檢測指標(biāo)趨于健康對照組，降低鉛毒性導(dǎo)致的機(jī)體氧化損傷。另外，羅伊氏乳桿菌2

8、1008可以降低急性鉛中毒引發(fā)炎癥因子（如IL-6，IFN-γ和TNF-α等）轉(zhuǎn)錄水平，提高抗炎因子（如IL-10等）轉(zhuǎn)錄水平，并且提高腸道緊密連接因子的轉(zhuǎn)錄水平，表明羅伊氏乳桿菌21008在體內(nèi)可以抑制鉛毒性引發(fā)的炎癥反應(yīng)，并且維護(hù)腸道粘膜屏障。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌21008具有調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路P38 MAPK和NF-κB的蛋白表達(dá)，促進(jìn)機(jī)體對鉛的解毒作用。值得注意的是，LAB-12d組在肝腎中鉛含量高于MRS-12d組，推測