降膽固醇益生乳酸菌篩選及其功能機(jī)理的研究.pdf

1、隨著人們生活水平的提高，高膽固醇含量膳食的攝入也逐漸增多，過(guò)高的膽固醇攝入量容易引發(fā)高膽固醇血癥。通常，血液中膽固醇濃度每上升1％，心腦血管疾病的死亡率就會(huì)上升2％。因此，保持人體內(nèi)膽固醇含量在正常范圍內(nèi)對(duì)于預(yù)防心腦血管疾病是至關(guān)重要的。國(guó)外研究表明許多乳酸菌在體內(nèi)和體外都有降低膽固醇的功效。本文通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中降膽固醇乳酸菌的篩選，鑒定，生物學(xué)活性，安全性，粘附和定殖及其降膽固醇的作用的研究，得出如下結(jié)論：
　　 1.本研

2、究以高膽固醇源培養(yǎng)基MRSO-CHOL為模型，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離純化得到66株具有降低膽固醇能力的乳酸菌菌株，從中篩選出5株具有較好降低膽固醇能力的菌株；在模擬消化環(huán)境下比較5株菌株的耐酸性、膽汁耐受能力和膽鹽降解(牛磺膽酸鈉)能力，最終確定GUO菌株為篩選目標(biāo)菌株。GUO菌株經(jīng)傳統(tǒng)微生物鑒定方法和API50CH細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，確定GUO菌株為植物乳桿菌(Lactobacilluss plantarum)。
　　 2.Lac

3、tobacillus plantarum GUO的生物學(xué)特性結(jié)果顯示：該菌株的最高，最低和最適生長(zhǎng)溫度分別為43℃，12℃和30℃；最高，最低和最適起始生長(zhǎng)pH分別為9.4，3.6和5.7。Lactobacillus plantarum GUO采用MRS培養(yǎng)，2 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，11 h進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)比較旺盛；而采用SKM培養(yǎng)則生長(zhǎng)比較緩慢，產(chǎn)酸能力也很弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus plantarum GUO的MR

4、S培養(yǎng)液4℃保藏條件下，S值為15.2 d，而在脫脂奶中的S值為116.3 d。
　　 3.益生菌的粘附和定殖是發(fā)揮其益生作用的第一步，也是最重要的一步。Lactobacillus plantarum GUO對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附結(jié)果表明：該菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi)存在量效關(guān)系，當(dāng)加入細(xì)菌濃度達(dá)到108 cfu/mL、孵育2 h時(shí)，粘附趨于飽和；穩(wěn)定期的Lactobacillus plantarum

5、GUO對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附效果最好。pH對(duì)于粘附作用具有顯著影響，在酸性范圍粘附性最強(qiáng)；Ca2+、Mg2+并沒有參與到Lactobacillus plantarum GUO對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附。因此，Lactobacillus plantarum GUO對(duì)Caco-2細(xì)胞的粘附是多種因素共同作用的結(jié)果，其中粘附素與受體的結(jié)合占主導(dǎo)地位。
　　 4.采用PCR-DGGE研究了Lactobacillus plantarum

6、GUO在大鼠腸道內(nèi)的定殖特性：結(jié)果表明：大鼠持續(xù)攝入Lactobacillus plantarum GUO發(fā)酵乳制品10 d后，Lactobacillus plantarum GUO在大鼠腸道的結(jié)腸、回腸、盲腸部位定殖，但在十二指腸和直腸部位未定殖。Lactobacillus plantarum GUO在腸道定殖結(jié)腸部位定殖時(shí)間最長(zhǎng)，停止灌胃后11 d仍有少量定殖；在結(jié)腸部位定殖量最高，灌胃停止3 d后檢測(cè)回腸定殖量達(dá)108 cfu/g

7、；回腸其次，最高約為107 cfu/g；盲腸僅第3組以及回腸第2組有定殖，約105 cfu/g。
　　 5.進(jìn)一步對(duì)Lactobacillus plantarum GUO的體外降膽固醇作用研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus plantarum GUO主要是通過(guò)同化與共沉淀兩種方式共同降低培養(yǎng)基中的膽固醇，其中同化作用占63.5％；共沉淀占36.5％。在此基礎(chǔ)上，對(duì)Lactobacillusplantarum GUO可能存在的降

8、膽固醇相關(guān)酶進(jìn)行了研究。采用硫酸銨沉淀、SephacrylS-100層析、SDS-PAGE電泳等分離純化得到了降膽固醇相關(guān)的酶，該酶的分子量為38,000 Da，最適底物濃度為150μg/mL，最適ATP濃度為2.5 mg/mL，最適pH為7.0，最適溫度為55℃；在60℃以下，pH6-0～9-0，酶活在30 min內(nèi)基本保持穩(wěn)定。
　　 6.本研究采用耐藥性試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)，急性毒性(經(jīng)口 LD5o)試驗(yàn)，90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)和

9、致畸試驗(yàn)評(píng)價(jià)了Lactobacillus plantarum GUO的安全性。試驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，Lactobacillus plantarum GUO對(duì)氟哌酸(NOR)和慶大霉素(GEN)兩種抗生素不敏感；對(duì)頭孢拉定(CEF)、四環(huán)素(TET)中度敏感；對(duì)氯霉素(CMP)和紅霉素(ERY)高度敏感。Lactobacillus plantarum GUO的Ames試驗(yàn)結(jié)果為陰性，無(wú)致突變作用；無(wú)急性毒性，最大耐受劑量MTD均大于

10、20000 mg/kg。90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)條件下，試驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)期間體征指數(shù)正常；臟體比，血液學(xué)指標(biāo)無(wú)顯著差異；各劑量組動(dòng)物臟器未發(fā)現(xiàn)明顯組織學(xué)病變。致畸試驗(yàn)結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)條件下，各劑量組試驗(yàn)動(dòng)物未見有母體毒性，胚胎毒性和致畸性。這表明Lactobacillusplantarum GUO是安全的，可以作為益生菌進(jìn)行深度的開發(fā)利用。
　　 7.由于Lactobacillus plantarum GUO具有良好的功能特

11、性和生物學(xué)活性，為了更好地發(fā)揮其益生作用，將其應(yīng)用于產(chǎn)品中具有更重要的現(xiàn)實(shí)意義。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)并優(yōu)化了Lactobacillus plantarum GUO的發(fā)酵乳配方Lactobacillusplantarum GUO發(fā)酵乳的基本配方為：15％SKM，5％葡萄糖，3％發(fā)酵劑。Lactobacillus plantarum GUO發(fā)酵乳飲料的基本配方為：發(fā)酵基料30％，蔗糖13％，果膠0.3％，檸檬酸鈉0.1％。
　　

12、8.為了了解Lactobacillus plantarum GUO在產(chǎn)品中的降膽固醇功效，參照保健食品功能性評(píng)價(jià)方法和程序，將Lactobacillus plantarum GUO發(fā)酵乳灌喂高血脂模型大鼠。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，含有活菌的Lactobacillus plantarum GUO發(fā)酵乳能夠顯著降低大鼠體內(nèi)的TC和LDL-C；而滅活的Lactobacillus plantarum GUO發(fā)酵乳則沒有此功能。這表明Lactob