維生素D在結(jié)核桿菌感染條件下對(duì)小鼠獲得性免疫表型和功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　脊柱結(jié)核是最常見(jiàn)的肺外結(jié)核,常導(dǎo)致椎體破壞和嚴(yán)重的并發(fā)癥,時(shí)刻威脅人類(lèi)的健康安全。2010年,世界衛(wèi)生組織報(bào)道每年大約有146萬(wàn)人死于結(jié)核。目前脊柱結(jié)核患者多數(shù)出現(xiàn)耐藥,甚至耐多種藥,使脊柱結(jié)核的化療面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。脊柱結(jié)核的化療源于結(jié)核病,深入研究結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制,有利于脊柱結(jié)核的治療。
　　維生素D在20世紀(jì)40年代末期曾用來(lái)治療結(jié)核,20世紀(jì)50年代中期,隨著抗結(jié)核藥物的出現(xiàn),維生素D用來(lái)治療結(jié)核的熱情已明

2、顯下降。然而,現(xiàn)在越來(lái)越多的結(jié)核患者感染多耐藥菌株,出現(xiàn)結(jié)核耐藥,常規(guī)的抗結(jié)核治療無(wú)效。因此,我們反思,維生素D可能在耐藥結(jié)核中起著重要的作用,但是有關(guān)維生素D在結(jié)核病治療的療效方面還存在分歧。Morcos等報(bào)道在結(jié)核的標(biāo)準(zhǔn)化療過(guò)程中加入維生素D,明顯提高患者的臨床療效,影像學(xué)也有所改變。Nursyam等也報(bào)道結(jié)核患者治療中補(bǔ)充維生素D,影像學(xué)表現(xiàn)有明顯改善。最近,Martineau等發(fā)現(xiàn)口服四倍劑量的維生素D3明顯提高TaqIVDR(

3、tt基因型)結(jié)核患者痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)換時(shí)間。相反,Wejse等認(rèn)為維生素D治療未能提高結(jié)核患者的臨床治療效果,而且,Sato等闡述低水平的維生素D是活動(dòng)性肺結(jié)核患者愈后良好的一個(gè)觀察指標(biāo)。Koo等研究發(fā)現(xiàn),在韓國(guó)人口中,維生素D水平與結(jié)核病的發(fā)展無(wú)直接相關(guān)性,在經(jīng)過(guò)抗結(jié)核治療后,25(OH)D水平下降。因此,維生素D在結(jié)核感染中的作用機(jī)理值得進(jìn)一步深入研究。
　　已有研究報(bào)道維生素D在結(jié)核感染的先天性與獲得性免疫中起著重要作用。最近,維生

4、素D如何影響結(jié)核先天性免疫已有眾多文獻(xiàn)明確闡明。然而,維生素D是如何影響結(jié)核獲得性免疫的研究還不夠深入。結(jié)核桿菌感染時(shí),樹(shù)突狀細(xì)胞是啟動(dòng)獲得性免疫的最基本細(xì)胞,樹(shù)突狀細(xì)胞在吞噬結(jié)核抗原后,其生物學(xué)作用發(fā)生了改變,細(xì)胞表面高表達(dá)表面共刺激分子,并逐漸移向淋巴結(jié),這一過(guò)程是樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟過(guò)程。而且,研究報(bào)道樹(shù)突狀細(xì)胞在吞噬Early Secretory Antigenic Target6-kDa(ESAT-6)抗原后,開(kāi)始啟動(dòng)CD4+T免

5、疫應(yīng)答。說(shuō)明樹(shù)突狀細(xì)胞在結(jié)核感染中啟動(dòng)獲得性免疫應(yīng)答,但維生素D在結(jié)核感染中是如何影響樹(shù)突狀細(xì)胞?相關(guān)研究還不夠深入。
　　因此,本課題的主要研究?jī)?nèi)容是:維生素D在結(jié)核桿菌感染條件下對(duì)小鼠獲得性免疫表型和功能的影響及機(jī)制。
　　方法：
　　1、建立維生素D缺乏、維生素D正常和維生素D充足三組小鼠動(dòng)物模型,ELISA方法檢測(cè)三組小鼠血清中25(OH)D和1,25(OH)2D3的差異。
　　2、檢測(cè)結(jié)核桿菌感染時(shí)三組

6、小鼠脾臟CD4+T和CD8+T百分比、CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值,同時(shí)用ELISA方法檢測(cè)脾臟細(xì)胞懸液經(jīng)TB-PPD誘導(dǎo)后,IFN-γ和IL-10水平。
　　3、小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)成樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)方法及鑒定,流式檢測(cè)CD11C,MHC-II,CD80,CD86,光鏡、掃描電鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　4、檢測(cè)不同維生素D水平對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)CD11C、MHC-II、CD80和CD86差異。
　　5、檢測(cè)不同濃度

7、維生素D樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞增殖影響。
　　6、檢測(cè)不同濃度維生素D對(duì)骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)成樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖影響。
　　7、檢測(cè)不同濃度維生素D對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌干擾素(IFN-γ),IL-2,IL-4,IL-6,IL-10和IL-12的差異。
　　8、檢測(cè)不同濃度維生素D對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)VDR和CYP27B1的差異。
　　結(jié)果：
　　1、25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D組、正常組和+D組分別是11.6±3

8、.56nmol/l和20±3.46pmol/l,76.5±9.13nmol/l和120±10.28pmol/l,78.1±9.16nmol/l和130±12.15pmol/l,正常組和+D組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而,25(OH)D和1,25(OH)2D3在-D組明顯少于正常組。
　　2、CD4+T在-D組、正常組、+D組百分比分別為27.1±0.6,23.62±0.42,19.46±0.32,三組之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD8+T細(xì)胞

9、的百分比分別是12.15±0.61,8.7±0.64,7.12±0.48,三組之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD4+T/CD8+T比值在-D組、正常組、+D組分別是2.23±0.15,2.71±0.21,2.73±0.31,三組之間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞因子IFN-γ在-D組、正常組、+D組水平分別為416.42±16.46、325.41±11.16、276.26±25.32(單位pg/ml),三組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞因子IL-10在-D

10、組、正常組、+D組分別為16.45±1.58、24.31±2.16、26.28±0.42(單位pg/ml),三組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、小鼠骨髓細(xì)胞成功誘導(dǎo)成樹(shù)突狀細(xì)胞。CD11C的陽(yáng)性率平均為87.23％,MHC-II的陽(yáng)性率平均為89.26%,CD86的陽(yáng)性率平均為58.94%,CD80的陽(yáng)性率平均為84.69%。光鏡、掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果示典型枝狀突起。
　　4、CD11C在對(duì)照組、25(OH)D3(100nM)

11、組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是84.64%±4.00,82.28%±7.27(p=0.85),81.17%±6.15(p=0.79)和32.25%±3.02(P<0.001),共刺激分子的表達(dá)在對(duì)照組、25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是:MHC-II:88.75%±4.14,85.92%±4.05(p

12、=0.54),83.37%±3.96(p=0.46)和46.65%±1.24(P<0.001);CD80:84.51%±8.63,84.75%±9.37(p=0.68),83.15%±8.48(p=0.61)and65.67±7.12(P<0.001);CD86:57.08%±9.55,51.32%±9.21(P<0.05),50.15%±8.76(P<0.05)and15.69%±3.12(P<0.001)。
　　5、25(OH

13、)D3(100nM)組和1,25(OH)2D3(10pM)組降低了T淋巴細(xì)胞的增殖,1,25(OH)2D3(100nM)組明顯降低了T淋巴細(xì)胞的增殖。
　　6、OD值在對(duì)照組、25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組及1,25(OH)2D3(100nM)組分別是0.61±0.25,0.54±0.25,0.49±0.24和0.21±0.15。對(duì)照組明顯促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的增殖,維生素D組抑制了樹(shù)突狀細(xì)胞的增

14、殖。
　　7、同對(duì)照組相比,在25(OH)D3(100nM)組、1,25(OH)2D3(10pM)組,IFN-γ、IL-2、IL-6和IL-10明顯升高,IL-4降低。然而,IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12在1,25(OH)2D3(100nM)明顯降低,IL-4明顯升高。
　　8、小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞能表達(dá)CYP27B1和VDR,在25(OH)D3(100nM)組,CYP27B1的表達(dá)高于對(duì)照組

15、,但在1,25(OH)2D3(100nM)和對(duì)照組無(wú)差別。VDR的表達(dá),在25(OH)D3(100nM)組比對(duì)照組低,但在1,25(OH)2D3(100nM)和對(duì)照組無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　　1、通過(guò)控制食物和光照,成功建立維生素D缺乏小鼠動(dòng)物模型。維生素D缺乏明顯影響小鼠抗結(jié)核免疫功能,提示維生素D缺乏與結(jié)核易感密切相關(guān)。
　　2、結(jié)核桿菌感染時(shí),維生素D通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞VDR和CYP27B1的表達(dá)來(lái)影響它的成熟和