甘露聚糖結合凝集素調節(jié)獲得性免疫應答的初步研究.pdf

1、本課題探討MBL在調節(jié)獲得性免疫應答中所扮演的角色。我們首先聯(lián)合應用配體和抗體親和層析柱子，從人新鮮冰凍血漿中提取高純度的具有生物學活性的天然MBL，并原核表達了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4)，然后對MBL負向調控LPS誘導的DC功能效應做了初步的機理分析：又選擇人B細胞系Raji細胞作為研究對象，分析MBL與其相互作用的特性及其對細胞功能的影響；又原核表達了模式抗原破傷風毒素C蛋白(TTC)，探討了MBL對PHA、PMA或PM

2、A/ionomycin活化的人T細胞系Jurkat細胞、外周血單個核細胞(peripheralbloodmonoeuclearcell，PBMC)、外周血新鮮分離的CD3+T淋巴細胞的增殖及分泌細胞因子的影響，并分析了MBL對DC提呈TTC抗原能力的影響。 本研究分4部分，茲分述如下。 一、聯(lián)合應用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然MBL蛋白 MBL是天然免疫系統(tǒng)的一個重要分子，許多有關凝集素途徑及其相關疾病

3、的理論研究、臨床疾病病人血清中MBL水平測定和抗MBL單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)制備等實際工作中，都需要高度純化的MBL制劑。然而，血漿中MBL濃度很低，正常人在40～3500μg/L之間，平均約900μg/L，血漿成份又非常復雜，獲得高純度MBL比較困難。 為獲取高純度天然MBL，本研究優(yōu)化了傳統(tǒng)提純MBL的方法。制備了抗人MBL-CRDmAb-Sepharose4B親和層析柱，聯(lián)合采用配體甘露

4、聚糖-Sepharose4B親和層析柱，將預處理人血漿3次上柱親和層析分離，分別用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCI(pH2.4)溶液洗脫結合蛋白。以SDS-PAGE、Westernblot和ELISA等技術鑒定純化產物。試驗結果顯示，所獲純化MBL為28KD和32KD肽鏈構成的功能性寡聚體，其純度較高，可與配體甘露聚糖結合并有效凝集酵母菌，還能與U937細胞膠凝素受體結合。本文報道的血漿預處理技術然后采用甘露聚糖-Sepharose

5、4B親和層析柱和抗人MBL-CRDmAb-Sepharose4B親和層析柱聯(lián)合層析技術，可以獲得高純度、高活性的MBL蛋白，為后續(xù)研究奠定了堅實的物質基礎。 二、MBL調節(jié)DC功能的機制初步研究 TLR是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識別受體，不僅能夠介導對病原微生物及其產物的識別，而且能夠參與獲得性免疫應答，被視為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在所有的TLR家族中，TLR4在未成熟DC(immaturedendriticc

6、ell，imDC)、Mo及Mψ泛表達，而且在識別LPS及其所介導的信號途徑中起著關鍵作用。 本課題組陳月博士研究發(fā)現(xiàn)，MBL對LPS誘導的imDC的成熟、細胞因子產生具有負向調控作用，但其作用機理并不明了。本研究繼續(xù)陳月博士的工作，以TLR4為切入點，探討MBL對LPS/TLR4介導的信號途徑的影響，進一步分析MBL對DC功能調節(jié)的機理。 實驗中首先原核表達了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4)，以蛋白質印跡試驗(We

7、sternblot)鑒定其特異性；接著用Westernblot和ELISA兩種方法分析MBL是否與sTLR4相互作用，并用流式細胞術(FCM)分析MBL與imDC的結合情況，競爭性抑制試驗分析MBL是否結合imDC表面的TLR4受體及影響后續(xù)LPS/TLR4介導的信號途徑。實驗結果顯示：(1)MBL可以直接以濃度依賴方式與可溶性TLR4蛋白胞外段結合：(2)MBL能夠以Ca2+依賴方式結合imDC，這種結合能被sTLR4蛋白及抗TLR4

8、mAb所抑制；(3)MBL能夠競爭性抑制LPS結合imDC；(4)MBL能夠抑制LPS誘導的核轉錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)活性。資料表明，MBL可通過結合imOC表面TLR4受體來調節(jié)LPS/TLR4介導的信號通路，提示MBL和TLR4之間存在聯(lián)系，在免疫調節(jié)中扮演重要的角色。 三、MBL對Raji細胞作用特性的研究 作為關鍵的天然免疫分子之一，MBL還能以鈣離子依賴、糖特異的方式結合自

9、身的Mo、DC，影響細胞因子的表達，提示MBL在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，并極有可能參與獲得性免疫應答。前文報道了MBL對DC的調節(jié)作用，而T、B淋巴細胞是獲得性免疫應答的介導者，但迄今未見MBL直接與淋巴細胞相互作用而參與調節(jié)獲得性免疫應答的報道。因此，研究MBL與淋巴細胞之間的相互作用具有重要意義。 本實驗中，我們選擇人B淋巴系Raji細胞作為對象，研究MBL是否與其結合及其結合特性，并對這種相互作用的后果進行了簡單分析，為探

10、索MBL直接參與B細胞介導的獲得性免疫應答提供初步的依據。實驗中首先采用細胞ELISA方法分析MBL能否與Raji細胞結合，并采用FCM著重研究其與Raji細胞結合特性。結果顯示，MBL以濃度依賴方式結合Raji細胞；MBL與Raji細胞的結合是Ca2+依賴的，且能被甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺所抑制；Clq或抗ClqRmAb能部分抑制MBL與Raji細胞結合：重組人MBL-CRD蛋白或MBL-CLR蛋白均能抑制MBL與Raji細胞結

11、合，兩者聯(lián)合應用則可完全阻斷這種結合。資料表明，B淋巴細胞系Raji細胞表達Ca2+依賴性、糖敏感的MBL受體(或結合蛋白)，包括對CLR特異和CRD特異的兩種受體，前者為MBL和Clq的共同受體。進一步的功能研究顯示，高濃度MBL(10～50mg/L)對Raji細胞的生長具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴關系。提示MBL作為一種重要的模式識別分子，不僅發(fā)揮天然免疫功能，而且可能在調節(jié)B細胞介導的獲得性免疫應答中起一定作用。 四、M

12、BL調節(jié)T淋巴細胞功能的初步研究 近年發(fā)現(xiàn)，與MBL同為C型凝集素超家族中膠凝素家族成員的SP-A和SP-D可抑制絲裂原激活的T細胞增殖，并下調其分泌IL-2；SP-A對T細胞增殖的抑制作用發(fā)生在絲裂原處理T細胞24h之后；SP-A和SP-D也能調節(jié)DC的功能，如SP-A抑制DC的分化成熟，SP-D增強DC的提呈抗原能力，促進抗感染獲得性免疫應答。然而，有關MBL免疫調節(jié)作用的報道極少，尤其未見其對T淋巴細胞直接調節(jié)作用的報道。

13、根據膠凝素家族各成員之間的結構和功能同源性，我們推測MBL很可能對T細胞的增殖及功能也有影響。因此，本實驗探討了在體外MBL對T細胞的調節(jié)的可能性。 破傷風毒素(tetanustoxoid，TT)能激活CD4+T淋巴細胞，因而被作為一種模式抗原，在CD4+T細胞介導免疫應答的研究中廣為應用。然而，傳統(tǒng)的破傷風類毒素(tetanustoxoid，TToid)是經甲醛脫毒而成，而破傷風桿菌可形成芽孢且毒性高，生產過程中有一定危險；甲

14、醛處理TT易造成污染，TToid還可能發(fā)生毒性逆轉。因此，TToid的研究應用受到一定限制。而TT的C片段(TTC)在動物實驗中能有效誘導產生中和抗體并可耐受外毒素攻擊，也可激活CD4+T細胞，是理想的破傷風亞單位候選疫苗，且具較好的安全性。因此，本研究選擇TTC作為模式抗原，研究MBL調節(jié)T細胞介導的獲得性免疫應答。 本實驗中，首先原核表達了模式抗原TTC蛋白，并對其抗原性、免疫原性進行分析，得到高度純化、免疫原性良好的TTC

15、蛋白，為后續(xù)研究提供了物質基礎。然后，采用密度梯度離心法自成年健康自愿者外周血分離單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，并采用尼龍毛柱分離CD3+T淋巴細胞。用非特異性刺激物PHA、PMA或PMA/ionomycin等分別活化人T淋巴細胞株Jurkat細胞、PBMC及CD3+T淋巴細胞，F(xiàn)CM測MBL對PHA、PMA活化的Jurkat細胞及CD3+T淋巴細胞結合能力，WST-1和ELIS

16、A檢測MBL對PHA、PMA或PMA/ionomycin活化的Jurkat細胞、CD3+T淋巴細胞及PBMC的增殖及分泌細胞因子IL-2或IFN-的影響；然后體外誘導DC和TTC特異性CD4+T淋巴細胞，WST-1法分析MBL對APC刺激同種異體T淋巴細胞及提呈模式抗原TTC能力的影響。結果表明，MBL能夠結合PHA、PMA活化Jurkat細胞及CD3+T淋巴細胞，MBL，能夠以濃度依賴的方式抑制PHA、PMA或PMA/ionomyci

17、n活化的上述各組細胞增殖及其分泌細胞因子IL-2或IFN-γ，同時MBL下調APC刺激同種異體T淋巴細胞增殖并減弱DC對TTC抗原的提呈能力，提示MBL能夠負向調節(jié)T細胞介導的獲得性免疫應答。 上述研究結果顯示，MBL，可直接與DC表面的TLR4相互作用，調節(jié)后續(xù)的NF-κB信號通路，提示MBL可能通過與TLR4相互作用來調節(jié)免疫應答。MBL還能直接調控T淋巴細胞、B淋巴細胞的功能，并負向調節(jié)控APC的抗原提呈能力，提示MBL可