甘露聚糖結(jié)合凝集素調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的初步研究.pdf

1、本課題探討MBL在調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答中所扮演的角色。我們首先聯(lián)合應(yīng)用配體和抗體親和層析柱子，從人新鮮冰凍血漿中提取高純度的具有生物學(xué)活性的天然MBL，并原核表達(dá)了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4)，然后對(duì)MBL負(fù)向調(diào)控LPS誘導(dǎo)的DC功能效應(yīng)做了初步的機(jī)理分析：又選擇人B細(xì)胞系Raji細(xì)胞作為研究對(duì)象，分析MBL與其相互作用的特性及其對(duì)細(xì)胞功能的影響；又原核表達(dá)了模式抗原破傷風(fēng)毒素C蛋白(TTC)，探討了MBL對(duì)PHA、PMA或PM

2、A/ionomycin活化的人T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmonoeuclearcell，PBMC)、外周血新鮮分離的CD3+T淋巴細(xì)胞的增殖及分泌細(xì)胞因子的影響，并分析了MBL對(duì)DC提呈TTC抗原能力的影響。 本研究分4部分，茲分述如下。 一、聯(lián)合應(yīng)用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然MBL蛋白 MBL是天然免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要分子，許多有關(guān)凝集素途徑及其相關(guān)疾病

3、的理論研究、臨床疾病病人血清中MBL水平測(cè)定和抗MBL單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)制備等實(shí)際工作中，都需要高度純化的MBL制劑。然而，血漿中MBL濃度很低，正常人在40～3500μg/L之間，平均約900μg/L，血漿成份又非常復(fù)雜，獲得高純度MBL比較困難。 為獲取高純度天然MBL，本研究?jī)?yōu)化了傳統(tǒng)提純MBL的方法。制備了抗人MBL-CRDmAb-Sepharose4B親和層析柱，聯(lián)合采用配體甘露

4、聚糖-Sepharose4B親和層析柱，將預(yù)處理人血漿3次上柱親和層析分離，分別用EDTA、D-甘露糖、Gly-HCI(pH2.4)溶液洗脫結(jié)合蛋白。以SDS-PAGE、Westernblot和ELISA等技術(shù)鑒定純化產(chǎn)物。試驗(yàn)結(jié)果顯示，所獲純化MBL為28KD和32KD肽鏈構(gòu)成的功能性寡聚體，其純度較高，可與配體甘露聚糖結(jié)合并有效凝集酵母菌，還能與U937細(xì)胞膠凝素受體結(jié)合。本文報(bào)道的血漿預(yù)處理技術(shù)然后采用甘露聚糖-Sepharose

5、4B親和層析柱和抗人MBL-CRDmAb-Sepharose4B親和層析柱聯(lián)合層析技術(shù)，可以獲得高純度、高活性的MBL蛋白，為后續(xù)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 二、MBL調(diào)節(jié)DC功能的機(jī)制初步研究 TLR是天然免疫系統(tǒng)中重要的模式識(shí)別受體，不僅能夠介導(dǎo)對(duì)病原微生物及其產(chǎn)物的識(shí)別，而且能夠參與獲得性免疫應(yīng)答，被視為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的橋梁。在所有的TLR家族中，TLR4在未成熟DC(immaturedendriticc

6、ell，imDC)、Mo及Mψ泛表達(dá)，而且在識(shí)別LPS及其所介導(dǎo)的信號(hào)途徑中起著關(guān)鍵作用。 本課題組陳月博士研究發(fā)現(xiàn)，MBL對(duì)LPS誘導(dǎo)的imDC的成熟、細(xì)胞因子產(chǎn)生具有負(fù)向調(diào)控作用，但其作用機(jī)理并不明了。本研究繼續(xù)陳月博士的工作，以TLR4為切入點(diǎn)，探討MBL對(duì)LPS/TLR4介導(dǎo)的信號(hào)途徑的影響，進(jìn)一步分析MBL對(duì)DC功能調(diào)節(jié)的機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)中首先原核表達(dá)了可溶性TLR4胞外段蛋白(sTLR4)，以蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)(We

7、sternblot)鑒定其特異性；接著用Westernblot和ELISA兩種方法分析MBL是否與sTLR4相互作用，并用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析MBL與imDC的結(jié)合情況，競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)分析MBL是否結(jié)合imDC表面的TLR4受體及影響后續(xù)LPS/TLR4介導(dǎo)的信號(hào)途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：(1)MBL可以直接以濃度依賴方式與可溶性TLR4蛋白胞外段結(jié)合：(2)MBL能夠以Ca2+依賴方式結(jié)合imDC，這種結(jié)合能被sTLR4蛋白及抗TLR4

8、mAb所抑制；(3)MBL能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制LPS結(jié)合imDC；(4)MBL能夠抑制LPS誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)活性。資料表明，MBL可通過(guò)結(jié)合imOC表面TLR4受體來(lái)調(diào)節(jié)LPS/TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路，提示MBL和TLR4之間存在聯(lián)系，在免疫調(diào)節(jié)中扮演重要的角色。 三、MBL對(duì)Raji細(xì)胞作用特性的研究 作為關(guān)鍵的天然免疫分子之一，MBL還能以鈣離子依賴、糖特異的方式結(jié)合自

9、身的Mo、DC，影響細(xì)胞因子的表達(dá)，提示MBL在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，并極有可能參與獲得性免疫應(yīng)答。前文報(bào)道了MBL對(duì)DC的調(diào)節(jié)作用，而T、B淋巴細(xì)胞是獲得性免疫應(yīng)答的介導(dǎo)者，但迄今未見(jiàn)MBL直接與淋巴細(xì)胞相互作用而參與調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的報(bào)道。因此，研究MBL與淋巴細(xì)胞之間的相互作用具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇人B淋巴系Raji細(xì)胞作為對(duì)象，研究MBL是否與其結(jié)合及其結(jié)合特性，并對(duì)這種相互作用的后果進(jìn)行了簡(jiǎn)單分析，為探

10、索MBL直接參與B細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答提供初步的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中首先采用細(xì)胞ELISA方法分析MBL能否與Raji細(xì)胞結(jié)合，并采用FCM著重研究其與Raji細(xì)胞結(jié)合特性。結(jié)果顯示，MBL以濃度依賴方式結(jié)合Raji細(xì)胞；MBL與Raji細(xì)胞的結(jié)合是Ca2+依賴的，且能被甘露糖、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺所抑制；Clq或抗ClqRmAb能部分抑制MBL與Raji細(xì)胞結(jié)合：重組人MBL-CRD蛋白或MBL-CLR蛋白均能抑制MBL與Raji細(xì)胞結(jié)

11、合，兩者聯(lián)合應(yīng)用則可完全阻斷這種結(jié)合。資料表明，B淋巴細(xì)胞系Raji細(xì)胞表達(dá)Ca2+依賴性、糖敏感的MBL受體(或結(jié)合蛋白)，包括對(duì)CLR特異和CRD特異的兩種受體，前者為MBL和Clq的共同受體。進(jìn)一步的功能研究顯示，高濃度MBL(10～50mg/L)對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，且呈劑量依賴關(guān)系。提示MBL作為一種重要的模式識(shí)別分子，不僅發(fā)揮天然免疫功能，而且可能在調(diào)節(jié)B細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答中起一定作用。 四、M

12、BL調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能的初步研究 近年發(fā)現(xiàn)，與MBL同為C型凝集素超家族中膠凝素家族成員的SP-A和SP-D可抑制絲裂原激活的T細(xì)胞增殖，并下調(diào)其分泌IL-2；SP-A對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用發(fā)生在絲裂原處理T細(xì)胞24h之后；SP-A和SP-D也能調(diào)節(jié)DC的功能，如SP-A抑制DC的分化成熟，SP-D增強(qiáng)DC的提呈抗原能力，促進(jìn)抗感染獲得性免疫應(yīng)答。然而，有關(guān)MBL免疫調(diào)節(jié)作用的報(bào)道極少，尤其未見(jiàn)其對(duì)T淋巴細(xì)胞直接調(diào)節(jié)作用的報(bào)道。

13、根據(jù)膠凝素家族各成員之間的結(jié)構(gòu)和功能同源性，我們推測(cè)MBL很可能對(duì)T細(xì)胞的增殖及功能也有影響。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了在體外MBL對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)的可能性。 破傷風(fēng)毒素(tetanustoxoid，TT)能激活CD4+T淋巴細(xì)胞，因而被作為一種模式抗原，在CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的研究中廣為應(yīng)用。然而，傳統(tǒng)的破傷風(fēng)類毒素(tetanustoxoid，TToid)是經(jīng)甲醛脫毒而成，而破傷風(fēng)桿菌可形成芽孢且毒性高，生產(chǎn)過(guò)程中有一定危險(xiǎn)；甲

14、醛處理TT易造成污染，TToid還可能發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)。因此，TToid的研究應(yīng)用受到一定限制。而TT的C片段(TTC)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體并可耐受外毒素攻擊，也可激活CD4+T細(xì)胞，是理想的破傷風(fēng)亞單位候選疫苗，且具較好的安全性。因此，本研究選擇TTC作為模式抗原，研究MBL調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。 本實(shí)驗(yàn)中，首先原核表達(dá)了模式抗原TTC蛋白，并對(duì)其抗原性、免疫原性進(jìn)行分析，得到高度純化、免疫原性良好的TTC

15、蛋白，為后續(xù)研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。然后，采用密度梯度離心法自成年健康自愿者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，PBMC)，并采用尼龍毛柱分離CD3+T淋巴細(xì)胞。用非特異性刺激物PHA、PMA或PMA/ionomycin等分別活化人T淋巴細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞、PBMC及CD3+T淋巴細(xì)胞，F(xiàn)CM測(cè)MBL對(duì)PHA、PMA活化的Jurkat細(xì)胞及CD3+T淋巴細(xì)胞結(jié)合能力，WST-1和ELIS

16、A檢測(cè)MBL對(duì)PHA、PMA或PMA/ionomycin活化的Jurkat細(xì)胞、CD3+T淋巴細(xì)胞及PBMC的增殖及分泌細(xì)胞因子IL-2或IFN-的影響；然后體外誘導(dǎo)DC和TTC特異性CD4+T淋巴細(xì)胞，WST-1法分析MBL對(duì)APC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞及提呈模式抗原TTC能力的影響。結(jié)果表明，MBL能夠結(jié)合PHA、PMA活化Jurkat細(xì)胞及CD3+T淋巴細(xì)胞，MBL，能夠以濃度依賴的方式抑制PHA、PMA或PMA/ionomyci

17、n活化的上述各組細(xì)胞增殖及其分泌細(xì)胞因子IL-2或IFN-γ，同時(shí)MBL下調(diào)APC刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖并減弱DC對(duì)TTC抗原的提呈能力，提示MBL能夠負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫應(yīng)答。 上述研究結(jié)果顯示，MBL，可直接與DC表面的TLR4相互作用，調(diào)節(jié)后續(xù)的NF-κB信號(hào)通路，提示MBL可能通過(guò)與TLR4相互作用來(lái)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。MBL還能直接調(diào)控T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的功能，并負(fù)向調(diào)節(jié)控APC的抗原提呈能力，提示MBL可