以蛋白酶體為靶點的地錢素M誘導前列腺癌細胞死亡的機制研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer, PCa)是歐美國家老年男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率明顯低于西方國家，但隨著人口老齡化、飲食結構的改變等，我國前列腺癌發(fā)病率，特別是晚期前列腺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢。據預計10年后，前列腺癌在我國的發(fā)病率可能會超過60-70/10萬，已成為威脅我國老年男性健康的惡性疾病之一。
　　前列腺癌是激素依賴性腫瘤，因此內分泌治療是治療前列腺癌的首選標準方案。

2、然而絕大多數前列腺癌患者經內分泌治療1-2年后易發(fā)展為激素難治性前列腺癌（Hormone Refractory Prostate Cancer，HRPC），對雄激素撤除不敏感，抵抗凋亡并伴隨侵襲轉移，預后差，死亡率高，目前臨床尚無有效的治療方法。由于HRPC的演變是復雜的多因素、多信號途徑參與的過程，其機制尚小完全清楚，因此尋找有效的治療靶點及機制，產生多種途徑的協(xié)同效應，是治療前列腺癌的有效策略之一。
　　第一部分地錢素M抑制蛋

3、白酶體的活性，誘導細胞內質網應激和凋亡泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)是真核生物細胞內重要的蛋白質質量控制體系之一。UPS通過將小分子蛋白泛素與靶蛋白的賴氨酸殘基共價結合，從而將其泛素化。泛素標記的蛋白被蛋白酶體特異性地識別并迅速降解。UPS通常降解受損變性蛋白、短壽命的調控蛋白等，對于細胞周期運轉、凋亡與分化、信號轉導等生理過程起著重要的調控作用。惡性腫瘤細胞內蛋白代謝紊亂，蛋白酶體

4、活性升高，UPS調節(jié)失衡，使得腫瘤細胞更加依賴UPS，以維持細胞內穩(wěn)態(tài)。因此，腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑更加敏感，蛋白酶體也成為腫瘤治療的新靶點，開發(fā)針對UPS的抑制劑在腫瘤治療中具有廣闊的前景，而天然化合物以其獨特的結構、多樣的生物學活性更是備受關注。
　　雙聯(lián)芐(Bisbibenzyls)是苔蘚植物中分離得到的一類大環(huán)多酚類化合物，因聯(lián)芐之間的連接方式不同、取代基不同而具有結構新穎、多樣的特點，具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物

5、活性。本課題組前期研究發(fā)現雙聯(lián)芐類化合物地錢素M(Marchantin M，Mar)顯著抑制前列腺癌細胞的增殖、促進其凋亡。由于地錢素M的結構與茶多酚的功能區(qū)域相似，而茶多酚已被證明是蛋白酶體的不可逆抑制劑。我們推測地錢素M可能具有抑制蛋白酶體活性的功能。為此，我們研究了地錢素M對重組純化的20S蛋白酶體、前列腺癌細胞內蛋白酶體活性的影響，并對其生物學效應進行了分析，取得了以下研究結果:
　　一、地錢素M顯著抑制蛋白酶體活性，是新

6、的可逆性蛋白酶體抑制劑
　　1.地錢素M顯著抑制蛋白酶體胰凝乳樣蛋白酶(ChT-L)和肽基谷氨酰多肽解酶(PGPH)活性。Mar顯著抑制重組純化的20S蛋白酶體中ChT-L和PGPH活性，呈劑量依賴性。其半數抑制率分別為6.99和5.33μM。但不影響胰蛋白酶樣活性。細胞實驗表明，地錢素M對激素非依賴性前列腺癌PC3，DU145細胞和激素依賴性前列腺癌LNCaP細胞內26S蛋白酶體顯示同樣的抑制作用，且呈時間和劑量依賴性。表達差異

7、譜基因芯片數據顯示，地錢素M并不影響UPS途徑中各組分的基因表達。
　　2.地錢素M是新的可逆性蛋白酶體抑制劑。通過Autodock vina軟件分析發(fā)現，地錢素M能與蛋白酶體的β1(PGPH)和β5(ChT-L)亞基結合。二者主要依靠氫鍵、疏水鍵等非共價鍵相互作用，其自由能分別為:-7.4 kcal/mol和-6.5kcal/mol。林-貝氏雙倒數作圖法表明，地錢素M對蛋白酶體的抑制呈現較典型的非競爭性抑制的方式。上述結果表明，

8、地錢素M是一種新的蛋白酶體可逆的抑制劑。
　　3.地錢素M抑制蛋白酶體活性，導致前列腺癌細胞內多泛素化蛋白累積，且呈時間、劑量依賴性。
　　二、地錢素M抑制蛋白酶體活性，導致內質網相關蛋白降解途徑(ERAD)受阻，誘導內質網應激和細胞凋亡
　　1.地錢素M介導的蛋白酶體抑制，抑制ERAD，誘導內質網應激。地錢素M處理前列腺癌細胞后，導致經ERAD降解的蛋白如突變蛋白CFTR△F508、SPC△4在內質網堆積;電鏡下觀察

9、到內質網腫脹，激光共聚焦結果顯示高濃度的地錢素M可引起內質網空泡化;Western blotting結果表明，內質網伴侶蛋白GRP78表達顯著上調、PERK及其下游eIF2。磷酸化水平升高;定量PCR分析顯示應激分子ATF6、ATF4及其靶基因ATF3表達顯著增加;IRE1激活并剪接XBP1的mRNA，激活XBP1。上述結果表明，地錢素M抑制蛋白酶體活性導致內質網內未折疊或錯誤折疊的蛋白累積，誘導內質網應激。
　　2.地錢素M誘導

10、前列腺癌細胞凋亡。地錢素M呈劑量依賴性抑制激素依賴、激素非依賴性前列腺癌細胞凋亡，且使激素依賴性細胞更易凋亡。Western blotting結果表明，地錢素M可激活內質網特異caspase4，從而激活caspase3，誘導凋亡。
　　3.Caspase非依賴途徑參與地錢素M誘導的細胞凋亡。在激素依賴的前列腺癌LNCaP細胞中，Caspase抑制劑z-VAD-fmk逆轉絕大多數地錢素M誘導的細胞死亡，而在激素非依賴的前列腺癌PC3

11、和DU145細胞中，z-VAD-fmk只能部分部分逆轉地錢素M介導的細胞死亡。上述結果表明，地錢素M主要通過caspase依賴的途徑誘導激素依賴性前列腺癌細胞凋亡，而通過caspase依賴和非依賴機制誘導激素非依賴性前列腺癌細胞死亡。
　　第二部分、地錢素M上調應激基因ATF3的表達而抑制激素依賴性前列腺癌細胞中AR的功能雄激素受體(Androgen receptor，AR)為核受體型轉錄因子。當雄激素（如睪酮、二氫睪酮）與AR結

12、合后，引起AR構象改變，使AR與熱休克蛋白解離、活化而轉移至核內，并形成同源二聚體與DNA分子中雄激素受體應答元件（AREs）結合，誘導下游靶基因如前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)等基因的轉錄表達，促進細胞生長和存活。因此，AR信號通路不僅在維持前列腺的正常發(fā)育、功能發(fā)揮中起主要作用，也是激素依賴性前列腺癌增殖的關鍵途徑，而且在激素非依賴性轉化過程中起決定性作用，并在約1/3的HRPC中持續(xù)

13、性高表達。AR基因擴增、突變、過表達以及AR激素非依賴性激活，均可引起AR功能的異?；罨?，是前列腺癌內分泌治療失敗、侵襲轉移、抵抗凋亡等惡性表型的重要機制之一。因此，有效抑制前列腺癌中AR的表達或和功能一直是倍受關注的研究課題。
　　ATF3(activating transcription factor3)作為轉錄因子ATF/CREB家族成員，通過其蛋白堿性區(qū)的亮氨酸拉鏈結合到特異DNA的ATF/CREB順式作用元件上，調控基因

14、表達。當DNA損傷、毒素暴露、氧化應激以及內質網應激時，ATF3可被迅速誘導表達，以維持細胞在應激條件下的基因組完整性和內穩(wěn)態(tài)。然而，在持續(xù)或過強的應激狀態(tài)下，ATF3可介導細胞凋亡。由于ATF3蛋白中的亮氨酸拉鏈可介導ATF3與多種蛋白相互作用。本課題第一部分研究結果顯示，地錢素M誘導內質網應激，顯著增加ATF3表達，且主要以caspase依賴的凋亡形式誘導激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP死亡。由于AR是LNCaP細胞增殖存活的關鍵調

15、控因子，我們研究了ATF3高表達對AR表達和功能的影響以及與LNCaP凋亡的關系，結果如下:
　　一、地錢素M通過內質網應激信號PERK/eIF2α/ATF4上調ATF3的表達
　　1.地錢素M在轉錄水平上調ATF3的表達。地錢素M顯著增加前列腺癌細胞中ATF3啟動子活性，促進其轉錄。利用MatInspector軟件分析ATF3啟動子區(qū)轉錄因子的結合位點，發(fā)現-22/-18區(qū)存在ATF的結合位點;通過構建ATF3啟動子及其系

16、列截短體和ATF結合區(qū)的點突變和缺失突變的報告基因載體。雙熒光素酶檢測結果表明，ATF結合位點對地錢素M誘導的ATF3轉錄激活至關重要。
　　2.地錢素M誘導的ATF3表達上調主要受內質網應激信號PERK/eIF2α/ATF4的調控。通過顯性負相關表達載體抑制PERK的活性或siRNA下調ATF4的表達均能顯著下調ATF3的表達，同時促進細胞存活。
　　二、地錢素M誘導的ATF3高表達促進LNCaP細胞凋亡
　　1.抑

17、制ATF3的表達促進細胞存活。利用顯性負相關或siRNA技術抑制ATF3的表達，細胞增殖實驗結果顯示LNCaP細胞的存活率顯著提高;AnnexinV-FITC/PI雙染結果表明，下調ATF3后，凋亡細胞顯著減少。
　　2.ATF3通過caspase途徑誘導細胞凋亡。Western-blotting結果顯示，降低ATF3的表達，可抑制caspase3的活化，使caspase3的底物PARP剪切減少。上述結果表明，地錢素M上調ATF3

18、的表達促進LNCaP經caspase依賴的途徑凋亡。
　　三、高表達的ATF3通過蛋白間相互作用抑制AR的功能、促進LNCaP細胞凋亡
　　1.地錢素M顯著上調ATF3蛋白水平。Western-blotting結果顯示，地錢素M顯著提高ATF3的蛋白表達，而且在激素依賴性前列腺癌細胞LNCaP中的誘導作用遠遠高于激素非依賴性前列腺癌細胞PC3和DU145。
　　2.ATF3與AR相互作用抑制其功能。免疫共沉淀結果顯示，

19、地錢素M誘導的ATF3與AR結合。在LNCaP細胞中過表達ATF3顯著下調AR的靶基因PSA的啟動子活性及其mRNA水平，其它AR調控的靶基因，如TMPRSS23和NKX3.1等表達均明顯下調。利用siRNA干擾ATF3后，上述AR靶基因都有不同程度的恢復表達。當AR缺失的PC3細胞共轉染AR，PSA啟動子和不同劑量的ATF3表達載體后，PSA啟動子活性隨ATF3表達量的增加而降低。以上結果說明地錢素M誘導的ATF3通過與AR結合而抑制

20、其功能，從而誘導LNCaP細胞凋亡。
　　第三部分、地錢素M誘導激素非依賴性前列腺癌細胞自噬性死亡在激素非依賴性前列腺癌細胞PC3和DU145中，阻斷caspase依賴的細胞凋亡，只能部分逆轉地錢素M誘導的細胞死亡，提示caspase非依賴的細胞死亡機制參與地錢素M誘導的細胞死亡過程。
　　已有研究表明，抑制蛋白酶體活性不僅能夠促進腫瘤細胞凋亡，還可通過多種機制誘導細胞自噬（autophagy）。自噬是真核細胞內除UPS外，

21、另外一種蛋白質質量控制系統(tǒng)，主要通過自噬泡包裹細胞胞液的內容物，包括衰老或受損的亞細胞器如線粒體、長壽命蛋白、入侵的微生物等運送至溶酶體降解，降解產物可以被細胞再次利用。當細胞面臨各種刺激、應激時，自噬可被誘導增強，可通過出現的自噬泡、自噬相關基因的表達等方法進行檢測。自噬對腫瘤細胞具有雙重作用，在腫瘤發(fā)生的不同階段，自噬所起的作用不同。在正常條件下，基礎性自噬可清除細胞內可能產生毒性作用的受損成分，抑制細胞的惡性轉化，預防腫瘤發(fā)生。當

22、腫瘤細胞面臨乏氧、營養(yǎng)缺乏以及化療藥物時，自噬的激活會提供能量、營養(yǎng)物質等而對腫瘤細胞起到保護作用，有利于細胞存活。然而多種應激而產生持續(xù)、過度的自噬時，也會導致細胞死亡，稱為自噬性細胞死亡(autophagic celldeath)，即Ⅱ型程序性細胞死亡。地錢素M處理的前列腺癌細胞，不僅使自噬的標志性蛋白LC3的表達增加，而且促進LC3(Ⅰ)向LC3(Ⅱ)轉變，表明地錢素M能誘導前列腺癌細胞產生自噬。因此，我們研究了地錢素M誘導的自噬

23、在前列腺癌細胞死亡過程中的作用，并對其信號通路進行了探討，取得了以下研究成果:
　　一、地錢素M抑制蛋白酶體活性，幾乎同時誘導自噬的發(fā)生
　　1.地錢素M抑制蛋白酶體活性伴隨著內質網應激和細胞自噬。時相分析結果顯示，地錢素M處理細胞1h時，蛋白酶體活性顯著下降，而在處理2h后內質網伴侶蛋白GRP78的表達顯著上調、自噬標志性蛋白LC3(Ⅱ)的表達開始上調并持續(xù)增強至48h。此結果表明，地錢素M抑制蛋白酶體活性后，隨即引起內質

24、網應激和細胞自噬。
　　2.地錢素M顯著誘導細胞產生自噬。LC3Ⅱ的表達升高提示該化合物可使細胞產生自噬。透射電鏡的結果明確顯示，地錢素M使激素非依賴性前列腺癌細胞中自噬泡和自噬溶酶體明顯增多，為自噬提供直接證據。激素非依賴性前列腺癌細胞瞬時轉染GFP-LC3表達載體或利用GFP-LC3穩(wěn)轉的U87細胞株，均可觀察到地錢素M極顯著地誘導LC3聚集、產生聚集熒光斑點。
　　3.地錢素M誘導自噬流量的增加?；蛐酒投縋CR結

25、果表明，地錢素M在轉錄水平誘導LC3基因表達升高，而其它自噬相關基因如Atg5、Atg7、Beclin1等表達幾乎沒有變化。Western blotting結果顯示地錢素M不僅上調LC3的蛋白水平，而且促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉變，并引起自噬底物p62下降。利用氯喹阻斷自噬泡和溶酶體融合進一步增加地錢素M誘導的LC3Ⅱ的累積，而利用自噬抑制劑3-MA則顯著抑制地錢素M誘導的LC3熒光斑點的聚集。這些結果表明地錢素M抑制蛋白酶體活性后，迅速

26、誘導內質網應激和細胞自噬，顯著增加自噬流量。
　　二、地錢素M誘導激素非依賴性前列腺癌細胞自噬性死亡
　　1.自噬抑制劑逆轉地錢素M誘導的細胞死亡。自噬抑制劑3-MA顯著下調地錢素M誘導的LC3Ⅱ的表達，同時促進細胞存活，降低地錢素M介導的細胞死亡。利用E-64D/Pepstatin A抑制溶酶體酶的活性，使地錢素M誘導的LC3Ⅱ的表達略有增加，但依然顯著增加細胞的存活，逆轉地錢素M誘導的細胞死亡。
　　2.抑制自噬相

27、關基因逆轉地錢素M誘導的細胞死亡。利用siRNA特異性的降低Atg5、Atg7、LC3的表達，均可顯著抑制LC3Ⅱ的表達或增加p62的表達而抑制自噬，同時顯著逆轉地錢素M誘導的細胞死亡，增加細胞存活率。然而干擾Beclin1后并不影響地錢素M介導的細胞死亡。上述結果表明，地錢素M誘導的自噬為自噬性死亡。
　　3.抑制自噬和caspase凋亡途徑完全逆轉地錢素M誘導的細胞死亡。由于caspase抑制劑只部分逆轉地錢素M誘導的激素非依

28、賴性前列腺癌細胞凋亡，采用siRNA下調Atg5的表達抑制自噬、同時聯(lián)用caspaSe抑制劑，幾乎完全逆轉地錢素M誘導的激素非依賴性前列腺癌細胞死亡。因此，自噬性細胞死亡和caspase依賴的細胞凋亡并存于地錢素M的細胞毒作用。
　　三、地錢素M通過內質網應激信號PERK/eIF2α和PI3K/Akt/mTOR途徑誘導自噬
　　1.地錢素M通過下調Akt1的表達抑制PI3K/Akt/mTOR途徑誘導自噬。Westernblo

29、tting結果顯示，地錢素M首先下調phospho-PDK1、phospho-Akt以及總Akt蛋白的表達水平，隨后降低phospho-mTOR和phospho-p70S6K的水平，表明地錢素M通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑而誘導自噬。定量PCR結果顯示，與Akt2、Akt3相比，地錢素M極顯著地抑制Akt1的mRNA水平。持續(xù)活化的Akt1表達載體能夠顯著逆轉地錢素M誘導的LC3Ⅱ表達及細胞死亡，而野生型Akt1無此作用。此結

30、果表明，地錢素M通過下調Akt的表達、抑制PI3K的活性，使Akt磷酸化水平下降，從而使mTOR失活而誘導自噬。
　　2.地錢素M誘導的內質網應激信號促進自噬。利用JNK抑制劑阻斷JNK/c-Jun信號并不影響地錢素M誘導LC3Ⅱ表達及細胞死亡，而轉染顯性負相關的PERK表達載體或siRNA抑制PERK，阻斷內質網應激信號PERK/eIF2α，地錢素M誘導的LC3Ⅱ表達顯著下調、并部分逆轉其誘導的細胞死亡。上述結果表明，內質網應激

31、信號PERK/eIF2。參與了地錢素M誘導的自噬及細胞死亡過程。
　　第四部分結論及創(chuàng)新點一、結論
　　1.雙聯(lián)芐化合物地錢素M抑制蛋白酶體活性，是一新型可逆性蛋白酶體抑制劑。
　　2.地錢素M通過抑制蛋白酶體活性、阻斷內質網相關的蛋白降解途徑而誘導內質網應激，促進前列腺癌細胞死亡。
　　3.地錢素M通過誘導內質網應激、促進應激轉錄因子ATF3的高表達;而高表達的ATF3通過與AR發(fā)生蛋白間相互作用抑制AR功能，

32、從而誘導激素依賴性前列腺癌細胞主要發(fā)生細胞凋亡。
　　4.地錢素M通過誘導內質網應激和細胞自噬，促進激素非依賴性前列腺癌細胞發(fā)生caspase依賴的凋亡和自噬性細胞死亡。
　　二、創(chuàng)新點與不足之處
　　1.首次報道雙聯(lián)芐化合物地錢素M靶向蛋白酶體、是一新型的可逆性蛋白酶體抑制劑。由于不可逆性蛋白酶體抑制劑易產生較大毒性，因此地錢素M的作用特點，使其成為很有研究價值的天然產物。
　　2.首次報道地錢素M可通過應激蛋

33、白ATF3而抑制AR的功能，進而促進細胞凋亡。由于 LNCaP細胞表達的是突變型AR，地錢素M的這種抑制作用將有益于AR持續(xù)活化的前列腺癌的治療。但地錢素M對野生型AR的作用有待于進一步研究。
　　3.首次報道地錢素M可誘導激素非依賴性前列腺癌自噬性細胞死亡。由于大多數化療藥物如紫杉醇等可引起腫瘤細胞產生自噬性保護機制，削弱其抗腫瘤效果，而且激素非依賴性前列腺癌細胞比激素依賴性細胞抗凋亡能力強，對藥物敏感性差。地錢素M對激素依賴、