新型蛋白酶體抑制劑地錢素M誘導(dǎo)前列腺癌PC3細胞凋亡的研究.pdf

1、前列腺癌(prostate cancer，PCa)作為常見的男性惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率較歐美國家低，但近年來呈明顯的增長趨勢，且中晚期患者的比例遠遠大于國外，由于PCa潛伏期長，發(fā)病機制復(fù)雜，尚無有效的治療手段，因此，PCa的預(yù)防與治療一直備受關(guān)注。目前激素撤除治療是中晚期前列腺癌的首選方法，通過手術(shù)、抗雄激素類藥物的激素阻斷治療，對約80％的前列腺癌有效。然而絕大多數(shù)腫瘤經(jīng)治療后，PCa發(fā)展為激素難治性前列腺癌(hormone re

2、fractory prostate cancer,HRPC)，對抗內(nèi)分泌治療，預(yù)后差，死亡率高。PCa由激素治療敏感到耐受的演變是復(fù)雜的多因素、多信號途徑參與的過程[1,2].
　　 盡管對HRPC的病理機制有相當(dāng)深入的研究，至今臨床無有效的治療方案，化療依然是主要的治療手段。針對雄激素受體途徑、抗凋亡基因、血管生成因子、生長因子受體、信號通路蛋白等靶點的各種化學(xué)藥物、疫苗、單克隆抗體等均能有效抑制前列腺癌細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，

3、顯示出良好的效果[3-5]。如多西紫杉醇常用于晚期HRPC的治療，通過穩(wěn)定微管、誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮作用，是唯一被證實可明顯延長HRPC患者生存期的藥物，使HRPC的化療取得了新的進展，同時也顯示出天然產(chǎn)物作為抗腫瘤藥物的巨大潛力。因此，研究HRPC的發(fā)病機制、探索新的治療靶點及方法，是預(yù)防與治療HRPC的有效策略。
　　 泛素-蛋白酶體(ubiquitin-proteasome system，ups)是哺乳動物細胞內(nèi)主要的蛋白水解酶

4、體系，能夠精確降解細胞內(nèi)各種靶蛋白，對于細胞周期運轉(zhuǎn)、細胞分化與凋亡、免疫應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程起著重要的調(diào)控作用。對惡性腫瘤細胞而言，蛋白代謝紊亂，UPS調(diào)節(jié)失衡，使UPS與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、多藥耐藥、免疫監(jiān)控逃逸等病理過程密切相關(guān)。而抑制UPS對腫瘤細胞比正常細胞更為敏感，可導(dǎo)致細胞周期阻滯、細胞凋亡等。因此UPS成為腫瘤治療的新靶點，蛋白酶體抑制劑(proteasome inhibitors)也成為一種非常有前景的抗腫瘤藥物[6,

5、7]。因此，發(fā)現(xiàn)新的蛋白酶體抑制劑為抗腫瘤藥物的研究提供了新思路，而天然產(chǎn)物以其獨特的結(jié)構(gòu)類型更是受到研究者的青睞[8]。
　　 苔蘚植物作為從水生到陸生過渡的一類高等植物，品種繁多，抗蟲害、抗腐爛等獨特的生物特性導(dǎo)致其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，包括萜類化合物、酚類化合物和聯(lián)芐類化合物等[9-15]，是發(fā)現(xiàn)藥效活性分子的寶貴資源。雙聯(lián)芐類化合物作為苔蘚植物的成分之一，是新型植物抗生素，具有廣泛的生理活性，具有抗菌、抗病毒、細胞毒等活性。

6、我們通過對50多種聯(lián)芐類化合物進行抗腫瘤活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中一些化合物具有很好的抑制腫瘤細胞增殖活性。雙聯(lián)芐化合物地錢素M(Marchantin M，Mar)具有抑制腫瘤細胞增殖活性，且對前列腺腫瘤細胞的抑瘤活性顯著。本文就雙聯(lián)芐化合物地錢素M抑制激素非依賴性前列腺癌PC3細胞增殖的機制進行了初步探索。
　　 首先通過細胞增殖實驗檢測地錢素M的抑瘤活性，結(jié)果顯示地錢素M對人肝癌HepG2細胞的抑制作用較弱，對人白血病K562細胞和

7、腺體瘤包括人乳腺癌MCF-7細胞、前列腺癌LNCaP、DU145和PC3細胞抑制作用比較明顯，特別是對激素非依賴性前列腺癌PC3細胞的增殖抑制作用尤為顯著，而地錢素M對正常人視網(wǎng)膜上皮細胞hTERT-RPE1細胞毒性作用較小，表明腫瘤細胞對地錢素M更為敏感。BrdU摻入實驗表明，地錢素M以濃度依賴的方式顯著抑制PC3細胞的增殖活性。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，地錢素M阻滯PC3細胞于G0/G1期。分析G0/GI期周期相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果顯示

8、，地錢素M誘導(dǎo)周期蛋白激酶抑制蛋白p21 cip1的表達，抑制CyclinD1的表達，同時使Rb蛋白的磷酸化程度降低，抑制細胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)變。另外，流式細胞術(shù)分析結(jié)果出現(xiàn)顯著的亞二倍體峰，提示地錢素M抑制細胞增殖可能與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)地錢素M處理后的PC3細胞的形態(tài)發(fā)生顯著變化，Giemsa染色和PI/Hoechest33342雙染結(jié)果顯示，細胞變圓，脫落明顯，且細胞形態(tài)出現(xiàn)凋亡細胞的特征性改變，DAPI染色觀

9、察到細胞核發(fā)生明顯的凋亡性變化。Westernblotting結(jié)果顯示，地錢素M處理后，PC3細胞內(nèi)的抗凋亡蛋白Bcl2的表達下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax的表達明顯增高，其Bax/BeL2的比率顯著增加。由于Caspase在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，我們的檢測結(jié)果表明，地錢素M能夠激活PC3細胞中Caspase3活性，促進多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的剪切，說明地錢素M可能以Caspase依賴的方式誘導(dǎo)PC3細胞凋亡。而經(jīng)地錢素M處理后

10、，細胞內(nèi)Caspase9和Caspase4的活性增加，但Caspase8活性并無明顯改變，表明線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑可能參與地錢素M誘導(dǎo)PC3細胞凋亡的作用，但其機制仍需進一步研究。由于地錢素M與荼多酚的結(jié)構(gòu)相似，后者已被證實具有抑制蛋白酶體的作用，因而我們檢測地錢素M對蛋白酶體的酶解活性的影響。檢測結(jié)果顯示，地錢素M在體外顯著抑制純化的20S蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性、多肽/谷氨酰水解酶活性，其抑制作用隨濃度的增加而增強。而經(jīng)地錢素M作用后

11、PC3細胞內(nèi)糜蛋白酶樣活性、多肽/谷氨酰水解酶活性隨著地錢素M作用濃度的增加、作用時間的延長而顯著降低，表明地錢素M具有明顯的抑制蛋白酶體活性的作用。因此，地錢素M可能是通過抑制蛋白酶體活性發(fā)揮了誘導(dǎo)PC3細胞凋亡的作用。
　　 總之，本研究結(jié)果表明，雙聯(lián)芐類化合物地錢素M具有抑制激素非依賴性前列腺癌PC3細胞增殖、引起細胞周期阻滯、誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。其作用機制可能是通過抑制蛋白酶體活性誘導(dǎo)細胞凋亡，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能參與其誘