氧調(diào)節(jié)蛋白(ORP150)在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：
　　 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的兩大主要系統(tǒng)之一,在細(xì)胞中的作用范圍非常廣泛,不僅負(fù)責(zé)降解細(xì)胞中80-90%的蛋白質(zhì),并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞許多生命過(guò)程。由于蛋白酶體活性狀態(tài)對(duì)細(xì)胞執(zhí)行不同生理功能十分重要,因此蛋白酶體具有成為影響細(xì)胞功能的重要藥物靶標(biāo)的潛在性。目前,蛋白酶體抑制劑作為一種新興的抗腫瘤藥物,已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注和認(rèn)可,其中硼替佐米(Bonezomib)已經(jīng)被美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于

2、治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤。
　　 分子量150kDa的氧調(diào)節(jié)蛋白(ORP150)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留熱休克蛋白超家族中一個(gè)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)多肽。ORP150的表達(dá)可以被許多細(xì)胞應(yīng)激損傷(如:低氧、血清饑餓、局部缺血、還原劑、衣霉素處理或抗代謝藥等)所誘導(dǎo)。有報(bào)道,ORPl50在腫瘤組織和癌細(xì)胞系中均高表達(dá),而ORP150在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤對(duì)應(yīng)激的抵抗以及耐藥性相關(guān)。
　　 研究表明,蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘

3、導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制存在一定程度的聯(lián)系。本課題組前期研究中已證明,蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。且相關(guān)研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)又調(diào)節(jié)了ORP150的表達(dá)。以上結(jié)果提示,蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)可能調(diào)控ORP150的表達(dá),但在甲狀腺癌細(xì)胞中ORP150的表達(dá)究竟是否受蛋白酶體抑制劑的調(diào)控,及其對(duì)蛋白酶體抑制劑細(xì)胞毒性的影響卻不甚明了。本實(shí)驗(yàn)選取不同的甲狀腺癌細(xì)胞系作為研究對(duì)象,探

4、討ORP150在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用,有助于我們深入理解蛋白酶體抑制劑抗腫瘤的分子機(jī)制,為增加腫瘤對(duì)蛋白酶體抑制劑的敏感性尋找新的靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)不同的甲狀腺癌細(xì)胞系(FR0、KTC1、KTC2、KTC3、8305C和8505C)。
　　 2、應(yīng)用Real-TimePCR法檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

5、激相關(guān)基因mRNA表達(dá)的變化。
　　 3、應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。
　　 4、應(yīng)用AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞中對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　 5、利用siRNA(smallinterferingRNA)/真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法,敲低/過(guò)表達(dá)ORP150、AT

6、F4、CHOP基因,解析ORP150在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1、Real-TimePCR和Western-blot結(jié)果顯示:在甲狀腺癌細(xì)胞中,蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)了ORP150的表達(dá)。
　　 2、利用siRNA敲低ATF4的表達(dá),蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)ORP150的表達(dá)受到抑制。
　　 3、利用siRNA敲低ORP150的表達(dá)促進(jìn)了蛋白酶體抑制劑MG132介導(dǎo)的細(xì)

7、胞凋亡,并且促進(jìn)了MG132對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　 4、細(xì)胞過(guò)表達(dá)ORP150,蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率降低,且抑制了MG132對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　 5、敲低ORP150的細(xì)胞增加了對(duì)蛋白酶體抑制劑細(xì)胞毒性的敏感性,且這種增敏效應(yīng)隨著CHOP的敲低而喪失。
　　 結(jié)論：
　　 1、蛋白酶體抑制劑MG132通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子ATF4誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞ORP150的表達(dá)。<