氧調節(jié)蛋白(ORP150)在蛋白酶體抑制劑誘導甲狀腺癌細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：
　　 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細胞中蛋白質降解的兩大主要系統(tǒng)之一,在細胞中的作用范圍非常廣泛,不僅負責降解細胞中80-90%的蛋白質,并參與調節(jié)細胞許多生命過程。由于蛋白酶體活性狀態(tài)對細胞執(zhí)行不同生理功能十分重要,因此蛋白酶體具有成為影響細胞功能的重要藥物靶標的潛在性。目前,蛋白酶體抑制劑作為一種新興的抗腫瘤藥物,已經得到越來越多的關注和認可,其中硼替佐米(Bonezomib)已經被美國食品及藥品管理局(FDA)批準用于

2、治療耐藥的多發(fā)性骨髓瘤。
　　 分子量150kDa的氧調節(jié)蛋白(ORP150)是內質網駐留熱休克蛋白超家族中一個新的內質網相關多肽。ORP150的表達可以被許多細胞應激損傷(如:低氧、血清饑餓、局部缺血、還原劑、衣霉素處理或抗代謝藥等)所誘導。有報道,ORPl50在腫瘤組織和癌細胞系中均高表達,而ORP150在腫瘤中的高表達與腫瘤對應激的抵抗以及耐藥性相關。
　　 研究表明,蛋白酶體抑制劑誘導細胞凋亡的機制與內質網應激誘

3、導細胞凋亡的機制存在一定程度的聯(lián)系。本課題組前期研究中已證明,蛋白酶體抑制劑誘導甲狀腺癌細胞凋亡的過程中,內質網應激發(fā)揮著重要的作用。且相關研究表明,內質網應激所誘導的未折疊蛋白反應又調節(jié)了ORP150的表達。以上結果提示,蛋白酶體抑制劑誘導細胞凋亡時可能調控ORP150的表達,但在甲狀腺癌細胞中ORP150的表達究竟是否受蛋白酶體抑制劑的調控,及其對蛋白酶體抑制劑細胞毒性的影響卻不甚明了。本實驗選取不同的甲狀腺癌細胞系作為研究對象,探

4、討ORP150在蛋白酶體抑制劑誘導甲狀腺癌細胞凋亡中的作用,有助于我們深入理解蛋白酶體抑制劑抗腫瘤的分子機制,為增加腫瘤對蛋白酶體抑制劑的敏感性尋找新的靶點。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng):培養(yǎng)不同的甲狀腺癌細胞系(FR0、KTC1、KTC2、KTC3、8305C和8505C)。
　　 2、應用Real-TimePCR法檢測甲狀腺癌細胞中對照組及實驗組ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它內質網應

5、激相關基因mRNA表達的變化。
　　 3、應用Western-blot法檢測甲狀腺癌細胞中對照組及實驗組ORP150、GRP78、ATF4、CHOP及其它內質網應激相關蛋白的表達差異。
　　 4、應用AnnexinV-PI雙染流式細胞術檢測甲狀腺癌細胞中對照組及實驗組細胞凋亡的變化情況。
　　 5、利用siRNA(smallinterferingRNA)/真核表達載體轉染細胞的方法,敲低/過表達ORP150、AT

6、F4、CHOP基因,解析ORP150在蛋白酶體抑制劑誘導甲狀腺癌細胞凋亡中的作用機制。
　　 結果：
　　 1、Real-TimePCR和Western-blot結果顯示:在甲狀腺癌細胞中,蛋白酶體抑制劑誘導了ORP150的表達。
　　 2、利用siRNA敲低ATF4的表達,蛋白酶體抑制劑誘導ORP150的表達受到抑制。
　　 3、利用siRNA敲低ORP150的表達促進了蛋白酶體抑制劑MG132介導的細

7、胞凋亡,并且促進了MG132對轉錄因子CHOP表達的誘導作用。
　　 4、細胞過表達ORP150,蛋白酶體抑制劑誘導的細胞凋亡率降低,且抑制了MG132對轉錄因子CHOP表達的誘導作用。
　　 5、敲低ORP150的細胞增加了對蛋白酶體抑制劑細胞毒性的敏感性,且這種增敏效應隨著CHOP的敲低而喪失。
　　 結論：
　　 1、蛋白酶體抑制劑MG132通過轉錄因子ATF4誘導甲狀腺癌細胞ORP150的表達。<