缺氧誘導大鼠海綿體平滑肌細胞表型轉化及紅景天苷干預作用.pdf

1、背景:陰莖勃起功能障礙是臨床上一種常見疾病，一線藥5-型磷酸二酯酶抑制劑仍有35％患者治療無效。海綿體平滑肌細胞是調節(jié)陰莖勃起及維持勃起的重要功能單位。各種誘發(fā)因素如糖尿病、高血壓、高血脂、前列腺癌根治術和心血管系統(tǒng)疾病等導致陰莖海綿體缺氧和平滑肌細胞減少等是ED并發(fā)癥主要的病理生理學共性。近年來大量研究發(fā)現平滑肌與多組織器官纖維化密切相關，在缺氧等多種因素刺激下，通過發(fā)生表型轉化參與組織重構。而海綿體平滑肌是否參與陰莖海綿體纖維化尚未

2、報道。紅景天苷具有抗缺氧作用，這在國內外均有大量報道。
　　目的:研究體內外缺氧對SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細胞(CCSMC)表型轉化及紅景天苷的干預作用。
　　方法:1.體外部分:采用組織貼壁法和酶消化法體外分離培養(yǎng)SD大鼠海綿體平滑肌原代細胞;應用細胞免疫熒光、透射電鏡方法鑒定SD大鼠CCSMC;采用缺氧小室建立細胞缺氧模型，并通過光鏡、透射電鏡檢測缺氧前后CCSMC形態(tài)及結構變化;采用MTT法和流式細胞技術檢測CCSMC

3、缺氧前后細胞活力、周期及凋亡情況;采用免疫組化、Western blotting和定量PCR等技術檢測CCSMC缺氧前后缺氧誘導因子(HIF-1α)、細胞表型相關標志物蛋白和基因(α-SMA、Vimentin、CNN1等)水平及其相關轉錄因子（Myocd、Elk-1及KLF等）水平;并進一步運用腺病毒技術沉默和過表達CCSMC的HIF-1α基因，驗證缺氧介導CCSMC表型轉化。
　　2.體內部分:采用切除SD大鼠雙側海綿體神經方法

4、建立大鼠ED缺氧模型，12周后采用多功能生物信息采集器檢測ICP;取陰莖組織固定。采用透射電鏡、HE染色等方法觀察陰莖海綿體結構、形態(tài)的改變。采用MASSON染色評估海綿體組織纖維化程度及采用免疫組化、Western Blotting等方法檢測陰莖海綿體組織HIF-1α表達水平及平滑肌表型轉化相關標志蛋白α-SMA、Vimentin等表達水平。
　　3.紅景天苷干預作用觀察:
　　1)細胞部分:采用紅景天苷低劑量(3ug/m

5、L)與高劑量(30ug/mL)預處理細胞，再進行缺氧48小時。采用光鏡、透射電鏡觀察缺氧前后CCSMC形態(tài)及結構;采用MTT法、流式細胞技術檢測紅景天苷對缺氧CCSMC模型的細胞活性及凋亡情況的影響;采用Western Blotting檢測紅景天苷對缺氧導致CCSMC表型轉化情況的影響，包括缺氧誘導因子HIF-1α表達和膠原(CollagenⅢ)合成、細胞表型標志蛋白（α-SMA、Desmin、Vimentin等）表達量的改變。

6、　　2)動物部分:SD大鼠雙側海綿體切除模型同上，分為假手術組、模型組和紅景天苷組。給藥組給予紅景天苷6mg&g，灌胃，一天一次，共12周，假手術組和模型組給予等量的水灌胃處理。12周后，ICP檢測及海綿體組織缺氧、纖維化及平滑肌細胞表型轉化等相關指標檢測同上。
　　結果:1.原代分離培養(yǎng)的CCSMC呈現梭形，α-SMA、desmin表達具有較高的陽性率，電鏡顯示細胞內可見大量肌絲;缺氧后出現CCSMC形態(tài)肥大，細胞內肌絲減少、粗

7、面內質網增多等變化。CCSMC缺氧后，在HIF-1α表達增高，TGF-β和膠原(collagen)合成增多;平滑肌細胞表型調控轉錄因子Myocd和Elk-1和KLF-4分別上調和下調;同時，CCSMC收縮型標志蛋白表達水平明顯下降，而CCSMC合成型標志蛋白表達水平明顯增高。HIF-1α沉默或過表達能分別逆轉或促進CCSMC表型轉化過程。
　　2.SD大鼠雙側海綿體神經切除后，勃起功能減退;平滑肌細胞出現肥大、腫脹變形，細胞核亦腫

8、大變圓，肌絲減少或消失，細胞器腫脹、空泡化明顯等征象。海綿體膠原分泌增多、平滑肌相對含量下降，發(fā)生纖維化;海綿體組織發(fā)生HIF-1α表達增高，海綿體組織平滑肌細胞α-SMA蛋白表達下降，Vimentin表達增加等變化。
　　3.紅景天苷能抑制體外缺氧誘導的CCSMC細胞凋亡，及CCSMC收縮型蛋白的表達下降和合成型蛋白的表達增高等改變;體內檢測結果顯示紅景天苷能有效降低陰莖海綿體組織缺氧誘導因子HIF-1α表達和纖維化程度;此外，

9、紅景天苷還能有效升高海綿體平滑肌細胞收縮型標志蛋白的表達和降低合成型標志蛋白表達。
　　結論:
　　1.成功建立了體外分離培養(yǎng)SD大鼠陰莖海綿體平滑肌原代細胞方法;
　　2.成功建立體外CCSMC缺氧模型;
　　3.體外缺氧導致CCSMC表型轉化，HIF-1α參與CCSMC表型轉化調控;
　　4.成功建立了SD大鼠雙側海綿體神經切除ED缺氧模型;
　　5.SD大鼠雙側海綿體神經切除ED缺氧模型導致陰莖