二甲雙胍對(duì)糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化的干預(yù)作用.pdf

1、目的:觀察糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)鈣化的影響及可能的機(jī)制,并探討二甲雙胍(Metformin,Met)對(duì)上述影響的干預(yù)作用。
　　 方法:1、體外培養(yǎng)VSMCs細(xì)胞株,在含10 mmol·L-1β-甘油磷酸鹽(β-GP)培養(yǎng)液(即鈣化培養(yǎng)液)中加入不同濃度(50、100、20

2、0、400 mg·L-1)的AGE-BSA共同孵育VSMCs不同時(shí)間(0,3,6,9d)。采用細(xì)胞層鈣沉積含量、Von kossa染色和細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性測定判斷細(xì)胞鈣化程度,RT-PCR、Western-blot檢測骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)mRNA及蛋白的表達(dá)。2、觀察不同濃度二甲雙胍(10-4mol·L-1、5x10-

3、5mol·L-1、10-5mol·L-1)對(duì)上述影響的干預(yù)作用。3、用200 mg·L-1 AGE-BSA干預(yù)鈣化培養(yǎng)液培養(yǎng)的VSMCs不同時(shí)間(12h,24h,48h,72h),在各時(shí)間點(diǎn)用western bloting及RT-PCR同時(shí)觀察細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)GRP-78及caspase-12蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:1、AGE-BSA呈時(shí)間和濃度依賴性增加VSMCs層鈣沉積含量和ALP活性,200 mg·L-1

4、 AGE-BSA與VSMCs共孵育10天,與對(duì)照組相比,細(xì)胞層鈣沉積含量(1.64±0.18 vs2.90±0.19,p<0.05)及ALP活性(174.44±7.62 vs262.54±17.95,p<0.05)明顯增加,Von kossa染色顯示細(xì)胞間大量棕褐色顆粒沉積；AGE-BSA促進(jìn)VSMCsBMP-2 mRNA和蛋白表達(dá),200 mg·L-1 AGE-BSA與VSMCs共孵育24 h,與對(duì)照組相比,BMP-2 mRNA(0.

5、301±0.032 vs0.598±0.049,p<0.01)及蛋白(0.307±0.015vs0.908±0.025,p<0.01)明顯增加。2、不同濃度二甲雙胍與AGE-BSA(200 mg·L-1)共同干預(yù)VSMCs10天后,與對(duì)照組相比,細(xì)胞層鈣沉積含量及ALP活性明顯降低(P<0.05)；二甲雙胍與AGE-BSA共同干預(yù)VSMCs24 h后,與對(duì)照組相比,BMP-2mRNA和蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)。3、

6、與對(duì)照組相比,200 mg·L-1AGE-BSA干預(yù)鈣化培養(yǎng)的VSMCs,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激指標(biāo)GRP-78、caspase-12的蛋白及mRNA表達(dá)均增加,GRP-78蛋白及mRNA表達(dá)在干預(yù)24h時(shí)達(dá)高峰,caspase-12 mRNA表達(dá)在48h時(shí)增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:1、AGE-BSA可明顯增加VSMCs層鈣沉積含量和ALP活性,上調(diào)BMP-2mRNA及蛋白水平的表達(dá),促進(jìn)VSMCs鈣化。2、二甲雙胍能抑制AGE-BSA誘導(dǎo)的VS