海水中胃腸道感染病毒的病原性檢測及風(fēng)險(xiǎn)評價(jià).pdf

1、胃腸道感染病毒是除細(xì)菌之外的引起胃腸道疾病的主要病原體之一，通過接觸娛樂用水或食用被污染的貝類感染人體。這類病毒主要來源于人畜糞便等排泄物污染的生活污水，在各種水環(huán)境中普遍存在，并且存活時(shí)間長，感染劑量低，可以通過娛樂用水或食用海產(chǎn)品感染人類。因此，建立其快速、高效的檢測技術(shù)，對于水傳播疾病的預(yù)防和控制是迫切需要的。然而目前尚沒有一種同時(shí)確定其感染性和快速定量的方法，給人體健康風(fēng)險(xiǎn)評估帶來了很大的障礙。因此，本論文從這一點(diǎn)出發(fā)，開展了以

2、下相關(guān)的工作。
　　 選取具有指示作用的胃腸道感染病毒-腸道病毒(EV)和感染性最強(qiáng)的胃腸道感染病毒-輪狀病毒(RV)為指示微生物，實(shí)現(xiàn)以下目標(biāo)：1.建立快速定量水環(huán)境中具有感染性病毒濃度的方法，同時(shí)探討不可培養(yǎng)病毒的病原性檢測方法；2.將此方法在渤海灣天津海域進(jìn)行了應(yīng)用與可行性分析；3.通過探討病毒在海洋環(huán)境中的存活時(shí)間和滅活機(jī)理，對病毒感染人體的健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了實(shí)際評估。
　　 主要研究內(nèi)容和研究成果如下：
　　

3、 1.分別建立了腸道病毒代表種脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)和RV的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合實(shí)時(shí)定量PCR(ICC-qPCR)檢測方法，克服了細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)單獨(dú)作用時(shí)的缺點(diǎn)，將細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間從7天縮短到了2天，并且靈敏度在real-timePCR方法的基礎(chǔ)上提高了1個(gè)數(shù)量級，為細(xì)胞病變不明顯或水環(huán)境中低污染濃度病毒的感染性檢測提供了良好的技術(shù)支持。
　　 2.在比較超濾和吸附-洗脫這兩種水環(huán)境中常用病毒濃縮方法的基礎(chǔ)上，就不同的濃縮體

4、積、不同孔徑濾膜對超濾法濃縮效率的影響進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，超濾濃縮法操作簡單、耗時(shí)短、對病毒感染性損傷小；在超濾法中，相對于在10 L海水中用超濾濃縮裝置對病毒進(jìn)行回收來講，病毒分別經(jīng)0.8μm和0.45μm孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜過濾后，再用超濾管直接對500 mL海水中病毒濃縮效果最好。
　　 3.于2010年12月到2011年9月應(yīng)用ICC-qPCR方法對渤海灣天津近岸海域表層海水中EV和RV進(jìn)行了為期一年的監(jiān)測。結(jié)果

5、顯示，在28個(gè)樣品中，PV的陽性檢出率為57％(16/28)，EV71和CoxsackievirusA16為4％(1/28)，RV為32％(9/28)。在該海域中，PV的濃度變化范圍為0.2～196 PFU/L；RV為2～244 PFU/L。通過電鏡和測序分析鑒定出PV均為Ⅰ型污染，而RV主要是Human rotavirus A的G1血清型污染，其次為G3型。
　　 4.建立了PV和RV的ELISA和特異性RT-PCR檢測方法，

6、并將這兩種方法進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，應(yīng)用到渤海灣表層海水的檢測中，試圖建立不可培養(yǎng)病毒的病原性檢測方法。結(jié)果證明該方法能夠克服兩種手段單獨(dú)作用時(shí)造成的假陽性弊端，并且在很大程度上與ICC-qPCR檢測結(jié)果一致，適合較高濃度污染的病毒檢測，但是由于其靈敏度有限，檢測微量病毒污染時(shí)可能會(huì)造成結(jié)果的低估。
　　 5.采取實(shí)驗(yàn)室加標(biāo)PV1疫苗株的方法，選取ICC-qPCR、大片段逐步步移PCR和核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)，探討了病毒在自然海水中的存活時(shí)間和降

7、解機(jī)理。結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)室不控溫、不同鹽度條件下，5.0×104 PFU/mL濃度的PV1在秋冬季最長存活時(shí)間為13周，最短為10周。溫度和抗病毒微生物是其滅活的主要影響因素，而鹽度影響不顯著。PV1的3'NCR受到損傷會(huì)造成病毒毒力下降，而5'NCR才是決定核酸感染性是否消失的關(guān)鍵。
　　 6.應(yīng)用評價(jià)模型對主要胃腸道感染病毒造成的人體健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，在該研究海域RV相對于PV是主要致病病原體。當(dāng)游泳者暴露體積為1

8、0 mL/d時(shí)，在該海域感染PV的年風(fēng)險(xiǎn)范圍為1.82×10-5(在最低濃度暴露1 d)～1.63×10-1(在最高濃度暴露10 d)，低于可接受年風(fēng)險(xiǎn)(7.0×10-3)的概率為62.5％(暴露1 d)～31.25％(暴露10 d)；暴露于RV的感染年風(fēng)險(xiǎn)范圍為1.17×10-2(在最低濃度暴露1 d)～9.93×10-1(在最高濃度暴露10 d)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了可接受的年風(fēng)險(xiǎn)。
　　 結(jié)論：本論文以PV和RV為試驗(yàn)對象，建立了I