復方潔澤1號抗生殖器皰疹病毒及其對VP16蛋白表達作用的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分 體外感染HSV-2模型的構建
　　目的:體外構建VK2/E6E7細胞及Vero細胞HSV-2感染模型，確定建模VK2/E6E7細胞、Vero細胞與HSV-2的最佳比例，明確HSV-2感染VK2/E6E7及Vero細胞的時間效應，為研究HSV-2致病機理及探索防治HSV-2方法奠定基礎。
　　方法:將VK2/E6E7細胞與HSV-2病毒共孵育，采用倒置顯微鏡和透射電鏡觀察H

2、SV-2感染VK2/E6E7細胞變化；倒置顯微鏡觀察HSV-2感染Vero細胞變化。測定病毒滴度，采用Reed-Muench兩氏法計算 TCID50。選用不同濃度的病毒液與細胞共孵育，確定建模時HSV-2與VK2/E6E7細胞、Vero細胞最佳比例；在病毒與細胞最佳比例確定的前提下，將病毒與細胞共孵育，自接種病毒開始計時，每隔1h于倒置顯微鏡觀察VK2/E6E7及Vero細胞感染HSV-2的病變情況，觀測HSV-2感染VK2/E6E7細

3、胞及Vero細胞的時間效應。
　　結果:倒置顯微鏡下見VK2/E6E7細胞變圓，融合，形態(tài)失常。透射電鏡顯示：VK2/E6E7細胞與HSV-2共孵育后，VK2/E6E7細胞結構破壞，胞核胞漿內(nèi)均可見大量完整的及囊泡狀不完整的病毒顆粒。倒置顯微鏡下見Vero細胞變圓，融合，脫壁，迅速死亡。測定HSV-2 TCID50為10-5.625/ml；96孔板每孔接種8000個VK2/E6E7細胞，與100μl10-2HSV-2病毒共孵育24

4、h及96孔板每孔接種6000個Vero細胞，與100μl10-1HSV-2病毒共孵育24h，可致50％細胞死亡；HSV-2分別與VK2/E6E7細胞和Vero細胞共孵育，兩種細胞均于12h開始出現(xiàn)細胞病變（CPE），細胞變圓，24h、48h則更加明顯，48h時可見大部分細胞死亡。
　　結論:HSV-2可體外感染VK2/E6E7與Vero細胞，并可在細胞內(nèi)完成復制增殖，最終破壞細胞正常結構。建模最佳條件為：100μl10-2HSV-

5、2病毒與8000個VK2/E6E7細胞共孵育24h，100μl10-1HSV-2病毒與Vero細胞共孵育24h，最終使細胞死亡達到50％。CPE隨著細胞與病毒共孵育時間的增加而愈明顯。
　　第二部分 潔澤1號及其主要成分對HSV-2干預作用的體外實驗研究
　　目的:確定潔澤1號及其主要藥物成分小檗堿對VK2/E6E7細胞及Vero細胞的最低無細胞毒濃度，研究潔澤1號及其君藥主要成份小檗堿對感染HSV-2的干預作用。
　

6、　方法:MTT法確定潔澤1號、小檗堿、阿昔洛韋對VK2/E6E7細胞及Vero細胞的毒性作用；根據(jù)MTT結果將每種藥物配制成高中低等幾個實驗濃度備用。細胞貼壁后，按如下分組進行處理：空白對照組、正常對照組、模型組、潔澤1號組、小檗堿組、阿昔洛韋組。24h后MTT法檢測細胞存活率，反映各藥物對HSV-2感染VK2/E6E7細胞及Vero細胞的干預作用。
　　結果:1.潔澤1號、小檗堿、阿昔洛韋對VK2/E6E7細胞的毒性作用：藥物與

7、細胞共孵育24h時，潔澤1號對VK2/E6E7細胞的IC50為173.417mg/ml，IC10為20.46mg/ml；小檗堿對VK2/E6E7細胞的IC50為13.928μmol/L，IC10為1.891μmolL。阿昔洛韋對VK2/E6E7細胞的IC50為4.183mg/ml，IC101.543mg/ml。2.潔澤1號、小檗堿、阿昔洛韋對Vero細胞的毒性作用：藥物與細胞共孵育24h時，潔澤1號對Vero細胞的IC50為227.15

8、5mg/ml，IC10為16.816mg/ml；小檗堿對Vero細胞的IC50為1681.66μmol/L，IC10為3.28μmol/L；阿昔洛韋對Vero細胞的IC50為18.762mg/ml，IC10為0.964mg/ml。3.HSV-2感染VK2/E6E7細胞模型中：模型組與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）。不同濃度的小檗堿（4μmol/L→0.25μmol/L）對HSV-2均有抑制作用，4μmol/L、2μmol/

9、L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05；p<0.05；p<0.05），分別與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05；p<0.05；p<0.05）；2μmol/L組與4μmol/L、1μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05；p

10、<0.05），1μmol/L組分別與4μmol/L、0.5μmol/L、0.25μmol/L相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05）。結合病毒抑制率和CPE，潔澤1號、小檗堿、ACV對VK2E6E7細胞體外實驗最佳濃度分別為6.25mg/ml、1μmol/L、0.15625mg/ml。4.在HSV-2感染Vero細胞模型中，模型組與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；不同濃度的潔澤1號（12.5mg/

11、ml→3.125mg/ml）對HSV-2均有抑制作用，12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml組分別與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05）；12.5mg/ml與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05），6.25mg/ml、3.125mg/ml組分別與正常組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05）；6.25mg/ml、3.125mg/ml組分別與12.5mg/ml

12、組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05），6.25mg/ml組與3.125mg/ml組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。不同濃度的小檗堿（6.25μmol/L→1.5625μmol/L）對HSV-2均有抑制作用，6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L組分別與模型組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05）；6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5

13、625mg/ml組分別與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05；p<0.05）；3.125μmol/L、1.5625μmol/L組分別與6.25μmol/L組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（p<0.05；p<0.05），3.125μmol/L組與1.5625μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　結論:潔澤1號及小檗堿均能對病毒產(chǎn)生抑制作用，并且抑制作用的強弱與藥物濃度有關。該抑制作用可能是藥物對病

14、毒的直接殺傷作用或者是藥物抑制了病毒粘附、穿入、復制中的任一環(huán)節(jié)。其具體機制尚需進一步研究。
　　第三部分 潔澤1號及其主要成份小檗堿對HSV-2 VP16蛋白表達的影響
　　目的:研究潔澤1號、小檗堿對HSV-2感染宿主細胞后病毒間層蛋白VP16的影響，探討潔澤1號抗HSV-2感染的可能途徑或機制。
　　方法:設置正常細胞對照組、模型組（M）、潔澤1號組(JV)、小檗堿組(BV)、阿昔洛韋組(AV)。基于MTT結果，

15、選擇最佳實驗濃度,待細胞貼壁后，按上述分組對細胞進行處理，再繼續(xù)培養(yǎng)24h，提取總蛋白，Western blotting法檢測病毒間層蛋白VP16的表達。
　　結果:1.培養(yǎng)皿（d=10cm）中VK2/E6E7細胞長滿后與10-3HSV-2共孵育24h，使用潔澤1號（批號20120810），Western blotting檢測VP16蛋白表達，模型組及各藥物組未檢測到VP16目的蛋白表達。按100μl10-2病毒與8000個VK2

16、/E6E7細胞比例造模，使用潔澤1號（批號20140308）后，實驗結果顯示：模型組與正常組相比VP16蛋白表達量顯著增多，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01），潔澤1號組、阿昔洛韋組、小檗堿組分別與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01；p<0.01）。潔澤1號組、小檗堿組、阿昔洛韋組分別與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01；p<0.01）。潔澤1號組與阿昔洛韋組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0

17、.05）。小檗堿組分別與阿昔洛韋組、潔澤1號組比較，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01）。2.培養(yǎng)皿（d=10cm）中鋪滿Vero細胞與10-3HSV-2共孵育24h，用潔澤1號（批號20120810）干預。模型組與正常組相比VP16蛋白表達量增多，差異有極顯著統(tǒng)計學意義（p<0.01），潔澤1號組、小檗堿組、阿昔洛韋分別與模型組相比，VP16表達量明顯減少，結果有極顯著統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01；p<0.01）。

18、潔澤1號組、小檗堿組分別與正常組相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01），阿昔洛韋組與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。潔澤1號組、小檗堿組分別與阿昔洛韋組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.01；p<0.01），潔澤1號組與小檗堿組相比，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。
　　結論:潔澤1號及其主要成分小檗堿可以抑制HSV-2感染VK2/E6E7和Vero細胞后其間層蛋白VP16的表達，可能為藥物抑制了病毒